Органотипические модели опухолей с использованием микрофлюидных технологий

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-30016

НазваниеОрганотипические модели опухолей с использованием микрофлюидных технологий

Руководитель Звягин Андрей Васильевич, Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №53 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова онкология, солидные опухоли, микрофлюидные системы, трехмерные модели опухолей, прецизионная медицина, персонализированная терапия, скрининг лекарств, иммуная терапия

Код ГРНТИ34.57.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В рамках предлагаемого проекта планируется проведение прорывных исследований в области биоинженерии органотипических конструктов для решения задач в области прецизионной медицины нового поколения, отвечающей на приоритетные для РФ вызовы в онкологии. Исследования будут проводиться в научном подразделении мирового уровня, Отделе иммунологии ИБХ РАН (далее, Лаборатория) под руководством ведущего учёного профессора Звягина, в прошлом, руководителя проекта Мегагранта и при поддержке руководителя Лаборатории академика Деева. Планируемая программа зиждется на тераностической платформе, созданной в Лаборатории. На сегодняшний день коллектив проекта прочно утвердился на переднем крае мировой науки в тераностике онкологических заболеваний со своими разработками в молекулярной иммунологии, сочетанной радиотерапии, наномедицине и биофотонике, что подтверждается публикациями в топовых журналах (Nat Biomed Eng., Nat Nanotechnol., PNAS, ACS Nano и др.), патентами и завершёнными предклиническими испытаниями. Трансляция разработок с высоким терапевтическим потенциалом в клиническую практику становится насущной задачей научного коллектива, равно как и российской фундаментальной науки в целом. Технология трёхмерных (3D) органотипических моделей опухолей с использованием микрофлюидных технологий оказалась прорывным решением, которое позволит реализовать трансляционный потенциал коллектива и объективно оценить перспективы и преимущества разработанных коллективами инновационных соединений. Самые перспективные соединения планируется в дальнейшем тестировать в доклинических и клинических испытаниях. Коллектив в целом представляет собой оптимальное сочетание именитых и молодых учёных, работающих в России и за рубежом, занимающих заметные позиции в российском научном сообществе. Программа исследований нацелена на создание технологии доступных и высокорелевантных органотипических микрофлюидных онкологических моделей (ОМОМ), воспроизводящих основные свойства биологии опухоли и ее реакции на терапевтические воздействия, которые будут исследоваться в контексте взаимодействия опухолевых клеток с микроокружением. Поставленная масштабная цель будет достигнута благодаря решению следующих задач: 1. Разработка и создание 3D органотипических моделей опухолей на базе микрофлюидных технологий нового поколения. 2. Разработка подходов к лечению онкологических заболеваний с использованием разработанных коллективом проекта тераностических агентов и моделей опухоли как единой динамической экосистемы. Созданная холистическая модель опухоли позволит провести уникальные исследования синергетической терапевтической эффективности разработанных соединений. 3. Применение отлаженной коллективом авторов органотипической модели опухоли с использованием биопсийных образцов опухолей будет способствовать эффективной персонализированной терапии онкологических больных.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Эс Х. А., Кокс Т. Р., Сарафраз-Язди Э., Тьери Ж. П., Варкиани М. Э. Pirfenidone reduces Epithelial-Mesenchymal Transition and 2 Spheroid formation in Breast Carcinoma Through Targeting 3 Cancer-Associated Fibroblasts (CAFs) Cancers (Basel), 13, 5118 (год публикации - 2021)
10.3390/cancers13205118

2. Шарма Ш., Звягин А. В. и Рой И. Theranostic Applications of Nanoparticle-Mediated Photoactivated Therapies Journal of Nanotheranostics, 2, 131–156 (год публикации - 2021)
10.3390/jnt2030009

3. Поликарпов Д. М., Кэмпбелл Д. Х., Заславский А. Б., Лунд М. Э., Ву А., Лу Я., Палапатту Г. С., Уолш Б. Дж., Звягин А. В. и Гиллатт Д. А. Glypican-1 as a target for fluorescence molecular imaging of bladder cancer International Journal of Urology, 28,12,1290-1297 (год публикации - 2021)
10.1111/iju.14683

4. Паламарчук А.И., Алексеева Н.А., Стрельцова М.А., Устюжанина М.О., Кобызева П.А., Куст С.А., Гречихина М.В., Бойко А.А., Шустова О.А., Сапожников А.М., Коваленко Е.И. Increased susceptibility of the CD57– NK cells expressing KIR2DL2/3 and NKG2C to iCasp9 gene retroviral transduction and the relationships with proliferative potential, activation degree and death induction response International Journal of Molecular Sciences, 222, 3326 (год публикации - 2021)
10.3390/ijms222413326

5. Парахонский Б. В., Шилягина Н. Ю., Гуслякова О. И., Воловецкий А. Б., Костюк А. Б., Балалаева И. В., Клапшина Л. Г., Лермонтова С. А., Толмачев В., Орлова А., Горин Д. А., Сухоруков Г. Б., Звягин А. В. A method of drug delivery to tumors based on rapidly biodegradable drug-loaded containers Applied Materials Today, 25, 101199 (год публикации - 2021)
10.1016/j.apmt.2021.101199

6. Прошкина Г. М., Шрамова Е. И., Шилова М. В., Зелепукин И. В., Шипунова В. О., Рябова А. В., Деев С. М., Котляр А. Б. DARPin_9-29-Targeted Gold Nanorods Selectively Suppress HER2-Positive Tumor Growth in Mice Cancers, 13, 5235 (год публикации - 2021)
10.3390/cancers13205235

7. Миркасымов А.Б. Ferrihydrite-mediated mononuclear phagocyte system blockade for improved tumor targeting of nanomaterials 6th International Symposium «Physics Engineering and Technologies for Biomedicine» and Schools for Young Scientists, 1 (год публикации - 2021)

8. Роман Акасов, Евгений В. Хайдуков, Мико Ямада, Андрей В. Звягин, Асада Лилахаваничкул, Леон Г. Лиансе, Тяньхонг Дай, Тарл Проу Nanoparticle enhanced blue light therapy Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 184, May 2022, 114198 (год публикации - 2022)
10.1016/j.addr.2022.114198

9. Виктория О. Шипунова, Вера Л. Коваленко, Полина А. Котельникова, Анна С. Согомонян, Ольга Н. Шилова, Елена Н. Комедчикова, Андрей В. Звягин, Максим П. Никитин и Сергей М. Деев Targeting Cancer Cell Tight Junctions Enhances PLGA-Based Photothermal Sensitizers’ Performance In Vitro and In Vivo Pharmaceutics, 14, 43 (год публикации - 2022)
10.3390/pharmaceutics14010043

10. Шрамова Елена И., Чумаков Степан Павлович, Шипунова Виктория О., Рябова Анастасия Владимировна, Телегин Георгий Борисович, Кабашин Андрей Владимирович, Деев Сергей Михайлович, Прошкина Галина Михайловна Genetically encoded BRET-activated photodynamic therapy for the treatment of deep-seated tumors Light: Science & Application, 11:38 (год публикации - 2022)
10.1038/s41377-022-00729-4

11. Прошкина Г.М., Шрамова Е.И., Рябова А.В., Катривас Л., Джаннини С., Малпичи Д., Леви-Калисман Я., Деев С.М., Котляр А.Б. Novel Small Multilamellar Liposomes Containing Large Quantities of Peptide Nucleic Acid Selectively Kill Breast Cancer Cells Cancers, 14(19) 4806 (год публикации - 2022)
10.3390/cancers14194806

12. И.В. Зелепукин, О.Ю. Грязнова, Б.В. Парахонский, Шилягина Н.Ю., О. И. Гуслякова, А.Б.Воловецкий, А.В. Звягин Biodegradable containers for drug delivery to tumours 2022 International Conference Laser Optics (ICLO), p. 1-1 (год публикации - 2022)
10.1109/ICLO54117.2022.9840088

13. Антон Поспелов, Ольга Кутова, Юрий Ефремов, Альбина А. Некрасова, Дарья Б. Трушина, София Д. Гефтер, Елена И. Черкасова, Лидия Б. Тимофеева, Петр С. Тимашев, Андрей В. Звягин и Ирина В. Балалаева Breast Cancer Cell Type and Biomechanical Properties of Decellularized Mouse Organs Drives Tumor Cell Colonization Cells, 12, 2030-2056 (год публикации - 2023)
10.3390/cells12162030

14. Котельникова Полина Александровна, Шипунова Виктория Олеговна и Деев Сергей Михайлович Targeted PLGA-Chitosan Nanoparticles for NIR-Triggered Phototherapy and Imaging of HER2-Positive Tumors Pharmaceutics (год публикации - 2023)

15. Семен И. Горенинский, Максим Е. Конищев, Евгений Н. Болбасов, Кирилл Евдокимов, Чан Туан Хоанг, Марина Е. Трусова, Шамиль Д. Ахмедов и Сергей И. Твердохлебов Physico-chemical evaluation of antiatherosclerotic coronary stent coatings based on poly(lactic acid) doped with functionalized Fe@C nanoparticles BioNanoScience (год публикации - 2024)

16. Даниил В Калиновский, Алексей В Кибардин, Ирина В Холоденко, Елена В Свирщевская, Игорь И Доронин, Мария В Коновалова, Мария В Гречихина, Федор Н Розов, Сергей С Ларин, Сергей М Деев, Роман В Холоденко Therapeutic efficacy of antibody-drug conjugates targeting GD2-positive tumors Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2022;10:e004646 (год публикации - 2022)
10.1136/jitc-2022-004646

17. Азиз Б. Миркасымов, Иван В. Зелепукин, Илья Н. Иванов, Ярослав Б. Беляев, Джулия Ш. Джалилова, Дарья Борисовна Трушина, Алексей Васильевич Яременко, Всеволод Ю. Иванов, Максим П. Никитин, П. И. Никитин, А. В. Звягин, С. М. Деев Macrophage blockade using nature-inspired ferrihydrite for enhanced nanoparticle delivery to tumor International Journal of Pharmaceutics, 621,121795 (год публикации - 2022)
10.1016/j.ijpharm.2022.121795

18. Калиновский Даниил В, Кибардин Алексей В, Ирина Холоденко, Елена Свирщевская, Игорь И Доронин, Мария В Коновалова, Мария В Гречихина, Федор Н Розов, Сергей С Ларин, Сергей М Деев, Роман В Холоденко Therapeutic efficacy of antibody-drug conjugates targeting GD2- positive tumors Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 10:e004646 (год публикации - 2023)
10.1136/jitc-2022-004646

19. Е. И. Шрамова, А. Ю. Фролова, В. П. Филимонова, С. М. Деев, Г. М. Прошкина Система для самоактивируемой адресной фотодинамической терапии на основе мультимодального белка DARP-NanoLuc-SOPP3 ACTA NATURAE, 15 №4 (59) 100-108 (год публикации - 2023)
10.32607/actanaturae.27331

20. Согомонян А.С., Котельникова П.А., Дёмин Д.Е., Миркасымов А.Б., Деев С.М., Звягин А.В. Optical imaging of combined fluorescent cellular spheroid s and study of their growth under the influence of chemotherapy Optics and Spectroscopy, 2024, Vol. 132, No. 3, 230-238 (год публикации - 2024)
10.61011/EOS.2024.03.58745.29-24

21. Фролова А.Ю., Ким Э.Е., Кононевич Ю.Н., Мартынов В.И., Деев С.М., Пахомов А.А. Octa-BODIPY dye for monitoring live cell parameters using fluorescence lifetime imaging microscopy Optics and Spectroscopy, 2024, Vol. 132, No. 4, 328-333 (год публикации - 2024)
10.61011/EOS.2024.04.58874.26-24

22. Стрельцова М.А., Паламарчук А.И., Вавилова Ю.Д., Устюжанина М.О., Бойко А.А., Величинский Р.А., Алексеева Н.А., Гречихина М.В., Шустова О.А., Сапожников А.М., Коваленко Е.И. Methodological Approaches for Increasing the Retroviral Transduction Efficiency of Primary NK Cells Current Pharmaceutical Design , 2024, 30(37), 2947-2958 (год публикации - 2024)
10.2174/0113816128314633240724060916

23. Беляев Я.Б., Зелепукин И.В., Котельникова П.А., Тихоновский Г.В., Попов А.А., Капитанникова А.Ю., Барман Дж., Копылов А.Н., Браташов Д.Н., Прихожденко Е.С., Кабашин А.В., Деев С.М., Звягин А.В. Laser-Synthesized Germanium Nanoparticles as Biodegradable Material for Near-Infrared Photoacoustic Imaging and Cancer Phototherapy Advanced Science, 2024, 11(20), е2307060 (год публикации - 2024)
10.1002/advs.202307060

24. Разали В.А.В., Янг Кс., Дёмина П.А., Атанова А.В., Хайдуков Е.В., Семчишен В.А., Дауэс Ю.М., Плахотник Т., Звягин А.В. Ruby Nanoflakes (Rubyene) for Efficient 2D Fo ̈ rster Resonance Energy Transfer: Implications for Engineered Emitters in Multiplexed Imaging ACS Applied Nano Materials, 2024, 7, 10, 11320–11329 (год публикации - 2024)
https://doi.org10.1021/acsanm.4c00881

25. Горенинский С.И., Мельник Е.Ю., Плотников Е.В., Ескова Д.Д., Звягин А.В., Больбасов Е.Н., Твердохлёбов С.И. Electrospinning of polyetherketoneketone fibers: the effect of fabrication regime on the morphology, physico-chemical and biological characteristics Polymer, 311 (2024) 127549 (год публикации - 2024)
https:/10.1016/j.polymer.2024.127549

26. Ефимова А.С., Устимова М.А., Фролова А.Ю., Мартынов В.И., Деев С.М., Фёдоров Ю.В., Фёдорова О.А., Пахомов АА. Styryl dyes for viscosity measurement and detection of pathological processes in mitochondria of living cells using fluorescence lifetime imaging microscopy, a critical study Optical Materials (год публикации - 2024)
10.1016/j.optmat.2024.116517

27. Зелепукин И.В., Шевченко К.Г., Деев С.М. Rediscovery of mononuclear phagocyte system blockade for nanoparticle drug delivery Nature Communications, 2024, 15(1):4366. (год публикации - 2024)
https://10.1038/s41467-024-48838-5

28. Горенинский С.И., Акимченко И.О., Коноплянников М.А., Сударев Е.А., Тимашев П.С., Звягин А.В., Твердохлёбов С.И. Immobilization of hydroxyapatite on polyetherketoneketone surfaces for improved cell adhesion Materials Letters, 2024, 362, 136227 (год публикации - 2024)
10.1016/j.matlet.2024.136227

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Разработка 3D-моделей для тестирования противораковых агентов. 3D-модели сфероидов, состоящие из клеток опухоли и стромы, представляют собой максимально приближенную систему к опухоли in vivo, позволяющую адекватно оценивать терапевтическое действие противоракового препарата с учетом межклеточных контактов. Чтобы иметь возможность оценивать методами конфокальной микроскопии морфологию, структуру и отклик на терапевтическое воздействие тестируемых лекарственных препаратов, были получены клеточные линии карцином, эндотелия и фибробластов, стабильно экспрессирующие гены спектрально различных флуоресцентных белков (BFP, GFP, TurboFP635/650). Проведено сравнение колориметрических и флуоресцентных тестов для оценки жизнеспособности клеток в 3D моделях опухоли в агарозных формах или микрофлюидных чипах AIM Biotech idenTx 3, а также для простых и смешанных сфероидов и сфероидов из биоптатов. 2. Изучения влияния 3D микроокружения на канцерогенез. Было показано, что наличие стромальных клеток в сфероиде смешанного типа способствует делению опухолевых клеток и разрастанию сфероида в толще коллагена. В 3D моделях опухоли в микрофлюидных чипах были подобраны эффективные комбинации препаратов противоопухолевых препаратов (паклитаксела, 0,8 кДа, и иммунотоксина DARP-LoPE, 42кДа). Для оценки изменения экспрессии генов, ассоциированных с эпителиально-мезенхимальным переходом и внеклеточным матриксом (ВКМ), были проанализированы данные РНК секвенирования образцов из областей модельного тумороида богатых стромальными (HUVEC и HMCAF) или раковыми клетками (MDA-MB-231). С учетом поправки на множественное тестирование, в клетках РМЖ (MDA-MB-231) не было найдено значимых отличий в экспрессии между областями богатыми стромальными (SR) или раковыми клетками (CCR). В фибробластах (HMCAF) между областями SR и CCR было обнаружено 541 дифференциально экспрессирующийся ген. Анализ функционального обогащения генов показал увеличение в клетках фибробластов экспрессии генов, связанных с развитием сосудистой сети, взаимодействием с цитокинами, клеточной подвижностью и внеклеточным матриксом. 3. Тестирование сочетанной тераностики in vivo. Протестировано противоопухолевое действие комбинации адресного иммунотоксина DARP-LoPE и паклитаксела в моделях HER2-положительного рака молочной железы (РМЖ) на животных: мышах Nude с ксенографтными ортотопическими опухолями РМЖ на основе привитых клеток линии РМЖ человека BT474-NanoLuc. Регистрация люминисценции люциферазы NanoLuc, экспрессируемой клетками опухоли BT474-NanoLuc у мышей Nude, в системе прижизненной визуализации IVIS показала, что уменьшение размеров опухоли у группы с комбинированной терапией продолжалось до конца эксперимента (41 день) и достигло 97%. Раздел 4. Разработка флуоресцентно-дифференцируемых генно-модифицированных композитных сфероидов. В 3D модели смешанных сфероидов, содержащих спектрально различные флуоресцентные клетки опухоли и стромы, методами конфокальной микроскопии было установлено, что каркас сфероида формируется клетками фибробластов, которые колонизируются клетками аденокарциномы. В опытах по изучению ответа базовой модельной системы смешанных сфероидов, состоящих из HER2-экспрессирующих опухолевых клеток аденокарциномы яичника с добавлением клеток эндотелия и фибробластов, на противоопухолевые препараты, показано, что наличие стромальных клеток в микроокружении опухоли понижает цитотоксический эффект при монотерапии в ~10 раз. В тоже время, сочетанное применение разных по механизму действия противоопухолевых агентов позволяет повысить цитотоксическое действие используемых препаратов. Для оценки жизнеспособности клеток нативного сфероида предложен метод определения жизнеспособности по детекции интенсивности люминесцентного сигнала. 5. Анализ действия NK-клеточных линий на 3D-опухоли. Известно, что короткое время жизни NK-клеток и быстрое истощение их функциональных свойств рассматривается как одно из ограничений в противоопухолевой терапии на основе NK-клеток. В рамках данного проекта на основе первичных NK-клеток получены клетки с генетическими модификациями, направленными на увеличение их пролиферативного потенциала: каталитической субъединицей теломеразы hTERT и трансгеном клеточного суицида индуцируемой каспазы-9 (iCasp9). Проведённый анализ противоопухолевой активности NK-клеток с разными типами генетической модификации против гетерогенных опухолевых сфероидов, которые состояли из клеток карциномы яичников SKOV-3, фибробластной линии BJ-5ta и линии эндотелиальных клеток EA.hy926 показал, что hTERT+iCasp9 NK-клетки проявляли самую сильную цитотоксичность. 6. Оптическая микроскопия сфероидов на основе мультиплексирования времени жизни фотолюминесценции С целью исследования проникновения и воздействия коллоидных частиц с раковыми клетками в их квази-нативном окружении была разработана и апробирована методика считывания оптических сигналов с нескольких биологических маркеров, позволяющая воссоздать и проанализировать картину взаимодействия частиц и сложной биологической системы в более полном контексте. Для расширения количества одновременно считываемых биомаркеров была разработана технология, позволяющая создавать наноагенты с настраиваемым временем жизни фотолюминесценции, а применение технологии FLIM позволило детектировать и различать близкие по спектру флуоресцентные молекулы и частицы, используемые для мечения и моделирования терапевтического карго. Применение нано- и микроагентов с регулируемым временем жизни τ позволило эффективно метить клетки-фагоциты и использовать их в сложных смешанных сфероидах (тумороидах) для in vitro моделирования поведения макрофагов и накопления частиц в опухолевых тканях. Раздел 7. Разработка и тестирование конъюгатов HER2-специфичных белков DARPin с препаратом MMAE. Получен ряд конъюгатов на основе HER2-специфичных мАт trastuzumab и скаффолдных белков дарпинов G3 и 9.29 с химиотерапевтическими препаратами MMAE или MC-PEG4-(MMAE)3, флуоресцентным белком mCherry, pH-чувствительным красителем pHAb Dye флуорофором FAM. Меченые соединения были использованы для изучения интернализации полученных конъюгатов через HER2-рецептор, что является важным параметром реализации цитотоксического действия адресных противоопухолевых препаратов. С применением различных ингибиторов эндоцитоза было показано, что за интернализацию комплекса с рецептором отвечают несколько механизмов, среди которых ключевую роль играют кавеол-опосредованный и FEME пути. Показана высокая эффективность цитотоксического действия полученных конъюгатов в отношении HER2-позитивных клеточных линий рака молочной железы и рака яичников в стандартных 2D условиях культивирования и 3D-моделях опухоли. По результатам работы опубликовано 9 статей, из них 4 статьи в журналах Q1.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Возможность практического использования результатов проекта в экономике и социальной сфере связана с перспективой реализации подходов персонализованной медицины с использованием доступной системы опухоль-на-чипе для построения оптимальной траектории лечения индивидуального пациента, а также для быстрейшей трансляции научных разработок в клиническую практику.