КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 21-79-20219
НазваниеРазработка научных основ создания экспертной системы для экспресс-диагностики хронических заболеваний на основе анализа массивов белков-маркеров в биологических жидкостях с помощью мультимодальных биочипов
Руководитель Маркелов Олег Александрович, Кандидат технических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет "ЛЭТИ" им. В.И. Ульянова (Ленина)" , г Санкт-Петербург
Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными
Область знания, основной код классификатора 09 - Инженерные науки; 09-609 - Автоматизированные комплексы для биологии и медицины
Ключевые слова технологии биомолекулярной экспресс-диагностики, 3D комплементарные пептидные структуры,аптамеры, селективное связывание, структурно-топологические дескрипторы белковых структур, извлечение полезных данных, алгоритмы совмещения 3D представлений, идентификация целевых биомаркеров, мультипараметрические биочипы
Код ГРНТИ76.13.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В настоящее время отмечается рост распространенности острых и хронических системных заболеваний у населения, таких как сердечно-сосудистые заболевания (инфаркт и инсульт), диабет, ожирение, артрит, ЛОР проблемы и др. На фоне распространения ВИЧ/СПИД, туберкулеза и малярии эти проблемы кажутся менее значимыми, однако статистика показывает, что именно хронические заболевания приводят к сокращению продолжительности жизни, повышению времени нетрудоспособности, инвалидизации и пр.
Специалистами отмечается важность своевременной и точной диагностики хронических заболеваний для их успешного лечения. Среди методов диагностики данных заболеваний ведущую роль играет биохимическая диагностика, которая позволяет получить наиболее точные диагностические признаки того или иного заболевания. В настоящее время средства биохимической диагностики таких заболеваний являются крайне трудоемкими, дорогостоящими (т. е. недоступными для широких слоев населения в рамках программ диспансеризации и/или скрининга состояния здоровья), недостаточно информативными. Поэтому очевидна необходимость поиска путей создания диагностических средств нового поколения, способных реализовать экспресс-мультипараметрическую диагностику, и имеющих потенциал развития в экспертные системы.
Наиболее перспективным направлением реализации таких систем представляется применение принципов протеомики и конвергентных подходов, включая биоинформатику, микро- и нанофотонику, технологии формирования микро- и наноструктур.
В данной работе будут решаться следующие задачи:
1) Селекции информативных кластеров целевых белков-маркеров, на примере сердечно-сосудистых заболеваний, с перспективой масштабирования на иные группы заболеваний
2) Разработки принципов создания 3D комплементарных пептидных структур (аптамеров), селективно связывающих рассматриваемые целевые белки-маркеры, включая:
а) систематизацию белковых структур на основе дескрипторов, описывающих локальную и глобальную связность молекул;
б) построение новых структурно-топологических дескрипторов на основе представления модели в форме молекулярной векторной машины, позволяющих количественно охарактеризовать межмолекулярные взаимодействия участков белков, перспективных для конструирования селективного лиганда (аптамера);
в) разработка и исследование математических методов и алгоритмов совмещения 3D представлений с заданными свойствами и решения на этой основе фундаментальной задачи совмещения разнородных изображений цифровых двойников олигопептидных аптамеров;
г) исследование и разработка методов визуализации, устраняющих разрыв между традиционными одномерными и многомерными представлениями путем введения информации о взаимном расположении белковых цепей в одномерное последовательное представление.
3) Исследование микрофлюидной подсистемы, динамики и кинетики массообмена в капилляре в потоке белков и разработка оптимальной топологии проточного устройства для доставки и селективного связывания в потоке целевых биомаркеров на адсорбционных площадках. Создание лабораторного прототипа микрофлюидного мультипараметрического биочипа для диагностики хронических заболеваний.
4) Создание научных и методологических основ системной диагностики и создания диагностической экспертной системы.
5) Изготовление и испытание лабораторных прототипов мобильных диагностических систем, включая мультипараметрические биочипы, считывающие устройства, содержащие подсистемы регистрации и анализа данных, экспертную систему. Испытание системы на моделях и клинических образцах крови.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Публикации
1.
Н.О. Ситков, Т.М. Зимина, В.А. Карасев, Д.И. Каплун, М.И. Богачев, А.Р. Каюмов, О.А. Маркелов
Automated Modelling and Validation of Oligopeptide Aptamers with High Affinity to Protein Markers of Cardiovascular Diseases
European Journal of Clinical Investigation, Vol. 51, Supp. 1, p. 98-99, 55ASM-0056 ST (год публикации - 2021)
10.1111/eci.13567
2. П.А. Ляхов, М.Р. Киладзе, Д.И. Каплун, А.С. Вознесенский Removal of Ocular Artifacts from the Electroencephalogram Signal Flow using Median Filtering Proceedings of the IEEE International Conference Automatics and Informatics'2021, Proceedings of the IEEE International Conference Automatics and Informatics'2021 (год публикации - 2021)
3.
Н.О. Ситков, Т.М. Зимина, В.В. Лучинин, А.А. Колобов, А.В. Корляков, А.А. Кострыкина
Технология формирования гибридных микрофлюидных биосенсорных систем на основе молекулярного распознавания для безметочного флюорометрического экспресс-детектирования белковых структур
Нано- и микросистемная техника, НАНО- И МИКРОСИСТЕМНАЯ ТЕХНИКА, Том 23, № 6, 2021, С. 300-306 (год публикации - 2021)
10.17587/nmst.23.300-306
Публикации
1.
Ситков Н.О., Зимина Т.М., Кострыкина А.А., Колобов А.А., Киселева М.А.
Fabrication Features of a Microfluidic System Formation for Hybrid-integrated Biosensors Based on Peptide Aptamers
Conference of Russian Young Researchers in Electrical and Electronic Engineering (ElConRus), pp. 1605-1611 (год публикации - 2022)
10.1109/ElConRus54750.2022.9755565
2.
Ситков Н., Зимина Т., Колобов А., Севостьянов Е., Трушлякова В., Лучинин В., Красиков А., Маркелов О., Галагудзе М., Каплун Д.
Study of the Fabrication Technology of Hybrid Microfluidic Biochips for Label‐Free Detection of Proteins
Micromachines, том. 13, вып. 1, с.1-20 (год публикации - 2021)
10.3390/mi13010020
3.
Маркелов О., Карасев В., Ситков Н., Зимина Т., Колобов А., Каплун Д.
Design of conjugated ionichydrogen bonds between peptide sequences and sites of protein biomarker of non-communicable diseases
European Journal of Clinical Investigation, Vol. 52 Suppl. 1, p. 98, 56ASM-0022 (год публикации - 2022)
10.1111/eci.13796.56asm0022
4.
Карпищенко С.А., Верещагина О.Е., Станчева О.А., Бибик П.Р., Каплун Д.И., Богачев М.И., Каюмов А.Р.
Case Report: Oncocytic Schneiderian Papilloma Originating From the Sphenoid Sinus
Frontiers in Medicine, номер 9, статья 621705, с. 1-6 (год публикации - 2022)
10.3389/fmed.2022.621705
Публикации
1.
Зимина, Т.; Ситков, Н.; Карасев, В.; Скорик, И.; Колобов, А.; Колобов, А.; Буненков, Н.; Лучинин, В.
Design of Peptide Ligand for Lactoferrin and Study of Its Binding Specificity
Chemosensors, Chemosensors 2023, 11(3), 162 (год публикации - 2023)
10.3390/chemosensors11030162
2.
Ситков, Н.; Рябко, А.; Колобов, А.; Максимов, А.; Мошников, В.; Пшеничнюк, С.; Комолов, А.; Алешин, А.; Зимина, Т.
Impedimetric Biosensor Coated with Zinc Oxide Nanorods Synthesized by a Modification of the Hydrothermal Method for Antibody Detection
Chemosensors, Chemosensors 2023, 11(1), 66 (год публикации - 2023)
10.3390/chemosensors11010066
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Для обеспечения эффективного экспертного контроля и управления процедурами отбора кандидатных аптамеров in silico был разработан программный модуль с пользовательским интерфейсом и расширенными возможностями визуализации. Входной информацией для программного модуля являются файлы формата PDB, содержащие комплексы взаимодействующих биомолекулярных структур, полученные либо на основе экспериментальных исследований (комплексы связанных белков, структура которых определена in vitro методом рентгеноструктурного анализа (RSA) ко-кристалла белков или альтернативными методами структурной визуализации), либо предсказаны на основе процедур геометрического совмещения экспериментально подтвержденных структур отдельных макромолекул (молекулярного докинга).
Был создан лабораторный образец мультимодального экспресс-диагностического биочипа с интегрированным набором биораспознающих элементов в виде иммобилизованных пептидных последовательностей (аптамеров) и платформа-ридер к нему. С помощью разработанной системы реализована технология автоматической иммобилизации на поверхности распознающих площадок биочипа двух разных пептидов одновременно.
С помощью изготовленного лабораторного прототипа микрофлюидного биочипа с усовершенствованной оптической системой детектирования была сформирована линейка мультипараметрических микрофлюидных биосенсоров для одновременного обнаружения в едином потоке белковых маркеров тропонина Т и лактоферрина с помощью пептидов ЛЭТИ-7 и ЛЭТИ-11, соответственно. Оба пептида иммобилизовывали на распознающие площадки биочипов с помощью изготовленной установки автоматизированного капельного нанесения, что позволило обеспечить постоянство характеристик распознающего слоя пептидов с перспективой для серийной реализации сенсорных чипов.
Была проведена серия экспериментов с титрацией целевых маркерных белков, по результатам которых установлено, что на неспецифичных к целевому белку распознающих площадках регистрировался практически равномерный флуоресцентный сигнал, близкий к фоновому. На финальном этапе тестирования мультипараметрического биосенсорного чипа в телячью сыворотку помещали смесь целевых белков тропонина Т (ТТ) и лактофреррина (ЛФ) в различных концентрациях. С учетом стандартного отклонения и коэффициента чувствительности пределы детектирования для тропонина T и лактоферрина составили 4 нг/мл и 5 нг/мл, соответственно.
На базе ЦДТИ НМИЦ им. Алмазова проводилась оценка специфичности взаимодействия полученных на предыдущем этапе аптамеров для взаимодействия с RBD доменом коронавируса методом поверхностного плазмонного резонанса. В ходе исследований был подтверждён низкий уровень неспецифических взаимодействий, что согласуется с результатами, полученными методами молекулярного докинга in silico на предыдущем этапе.
С целью оценки работоспособности предложенных решений в условиях, максимально приближенных к сценариям реальной клинической диагностики, проводилась оценка возможности распознавания наличия целевых белков в сыворотке крови (миелопероксидазы) с помощью аптамеров путем исследования взаимодействия методом поверхностной биослойной интерферометрии (BLI). Эксперименты проводились на платформе BLItz (FortéBio) с использованием высокоточных стрептавидиновых (SAX) биосенсоров (FortéBio). В исследовании были использованы образцы сыворотки, предоставленные СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (на использование образцов в научных исследованиях получены информированные согласия пациентов) с различным содержанием антител к миелопероксидазе (от 40 до 400 нг/мл). Раствор FBS (телячья фетальная сыворотка) служил отрицательным контролем связывания. Все эксперименты по связыванию проводились в трех повторах, и сигналы от этапов ассоциации усреднялись.
Результаты исследований показали, что на новом сенсоре наблюдается 2-кратное снижение сигнала на второй раунд связывания с сывороткой, имеющей сходное содержание антител. Далее наблюдается постепенное снижение сигнала с уменьшением содержания антител в сыворотках. Связывание с FBS приводит к получению значимо более низкого сигнала по сравнению с сыворотками, что позволяет сделать вывод о специфичности технологии к сыворотке человека. При этом уровень сигнала BLI и содержание антител в сыворотке имеет достоверную корреляцию, (коэффициент корреляции Спирмена r=1.0 p=0.0028), линейный регрессионный анализ зависимости сигнала BLI от содержания антител показал возможность предсказания содержания антител к миелопероксидазе (коэффициент детерминации Пирсона R^2=0.84).
Для оценки специфичности отклика, эти же сыворотки были проанализированы с применением сенсора с иммобилизованными неспецифическим пептидом LETI6. При этом показано, что неспецифический пептид LETI6 также связывает биомолекулы из сывороток, при этом также сохраняется корреляция уровня сигнала BLI и содержания антител (коэффициент корреляции Спирмена r=0.71 p=0.021). Следовательно, значительная часть сигнала, регистрируемого сенсором, является неспецифическим и, по всей видимости, обусловлена связыванием не миелоперокидазы, а других белков плазмы крови. С другой стороны, при высоких концентрациях антител к миелоперокидазе, наблюдаются значимые различия между специфическим пептидом LETI8-1 и неспецифическим пептидом LETI6. Следовательно, данную систему можно использовать для детекции миелоперокидазы в высоких концентрациях, что может представлять основу тревожного экспресс-теста.
С целью оценки возможности снижения стоимости анализа исследовалась возможность повторного исползования сенсоров, однако при этом, начиная со второго цикла измерений наблюдалось систематическое падение уровня сигнала в 6 раз, на четвертый цикл уровень сигнала снижается в 7 раз, что приводит к дальнейшему снижению чувствительности диагностической системы.
Следовательно, происходит необратимое связывание сенсора с биомолекулами сыворотки, однако, начиная со второго цикла емкость сенсора стабилизируется, хотя и на низком уровне. На основании этих данных можно сделать вывод о целесообразности однократного использования сенсора, что обуславливает актуальность разработки отечественной технологии изготовления дешевых одноразовых сенсоров в случае трансляции технологии в диагностические системы.
Публикации
1.
Синица А., Каюмов А., Зеленихин П., Порфирьев А., Каплун Д., Богачев М.
BCAnalyzer: A Semi-automated Tool for the Rapid Quantification of Cell Monolayer from Microscopic Images in Scratch Assay
Lecture Notes in Computer Science, vol 13920, pp 256–269. (год публикации - 2023)
10.1007/978-3-031-34960-7_18
2.
Хасанова Д.И., Ситков Н.О., Иванов Н.А., Гареев К.Г., Зимина Т.М.
Study of Miniature Planar Traps for Sample Preparation in Fluorimetric Microfluidic Biosensors
2024 Conference of Young Researchers in Electrical and Electronic Engineering (ElCon), 2024 Conference of Young Researchers in Electrical and Electronic Engineering (ElCon), pp. 945-948 (год публикации - 2024)
10.1109/ElCon61730.2024.10468225
Возможность практического использования результатов
Возможность практического использования результатов проекта в экономике и социальной сфере заключается в возможности трансляции предложенных решений, включая системы специфичного детектирования патогномоничных маркеров различных заболеваний, в первую очередь сердечно-сосудистых, в носимые инструментальные диагностические системы, что позволит оснастить ими мобильные медицинские бригады системами экспресс-диагностики на основе разработанных технологий.