Поиск и характеристика новых систем бактериального иммунитета и вирусных анти-рестрикционных белков

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00004

НазваниеПоиск и характеристика новых систем бактериального иммунитета и вирусных анти-рестрикционных белков

Руководитель Мушарова Ольга Сергеевна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий» , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова Защитные системы прокариот, взаимодействие фагов с бактериями-хозяевами, функциональная метагеномика, бактериофаги, анти-рестрикция

Код ГРНТИ34.15.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В последнее десятилетие произошла настоящая революция в области изучения защитных механизмов прокариот. Этот прогресс был обусловлен увеличением доступности геномных данных и развитием биоинформатических алгоритмов, которые позволяют предсказывать функции генов на основе их совместной локализации. Активное изучение микробного пангенома позволило предсказать множество новых типов защитных систем бактерий и архей, в дальнейшем часть из них была экспериментально подтверждена в работе с модельными организмами. Тем не менее, мы можем предположить, что уже известное разнообразие представляет собой лишь верхушку айсберга, и множество типов микробных противовирусных систем все еще ждут своего открытия. Обнаружение новых генов защитных систем основано на их совместной локализации с генами, которые уже описаны и подтверждены как антивирусные - такие кластеры генов названы островками защиты. В то же время большая доля генов в микробных геномах все еще может рассматриваться как “темная материя”, т.е. кодирует белки с неизвестными функциями. Островки защиты, состоящие исключительно из генов с неизвестными функциями, не могут быть обнаружены с помощью используемых в данный момент методологических подходов. Этим обусловлена необходимость развития новых методик для обнаружения генов, которые не имеют тенденции к совместной локализации с классическими системами защиты (CRISPR-Cas системы прокариот - один из примеров такого поведения). Еще одним недостатком биоинформатических методов является их ориентация на широко распространенные системы защиты: во избежание ложноположительных результатов учитываются только гены, которые сильно обогащены в островках защиты и встречаются во множестве геномов. Несмотря на высокую эффективность в предсказании потенциальных генов защиты от фагов, методы in silico все еще ограничивают наше понимание полного разнообразия систем устойчивости к фагам в микробной популяции. Одним из решений данной проблемы является предлагаемый в настоящем проекте функциональный метагеномный подход направленный на прямое обнаружение систем защиты от фагов в микробных сообществах. Компактные системы защиты от фагов можно экспериментально идентифицировать при помощи плазмидных библиотек, кодирующих фрагменты метагеномной ДНК. Применение фаговой селекции к бактериальной культуре, несущей такую метагеномную библиотеку, уничтожит фаго-чувствительные клетки и позволит эффективно размножиться клеткам, экспрессирующими гены защиты от фага. Такой подход не требует предварительных знаний о последовательности ДНК в метагеномном образце и может позволить отобрать даже редкие защитные гены. В то же время с помощью предлагаемого метода можно характеризовать и валидировать набор систем защиты от фагов в образце конкретного микробного сообщества - «defensome». Данная информация может быть весьма ценным исходным материалом при применении фаговой терапии. С другой стороны - описание функционального набора систем защиты обогатит наше понимание взаимодействия фаг-хозяин в природных средах, и позволит проанализировать распространенность и сочетаемость различных систем защиты от фагов с экологической и эволюционной точек зрения. Еще одно потенциальное применение описанного подхода - обнаружение вирусных анти-рестрикционных белков. В ходе эволюции бактериофаги научились противодействовать практически любой известной системе бактериального иммунитета, и, предположительно, большая часть вирусных генов с неизвестными функциями представляет собой анти-рестрикционные белки. Тем не менее, по сравнению с описанием микробных систем защиты, мы наблюдаем значительное отставание в нашем понимании разнообразия вирусных анти-рестрикционных стратегий, так как отсутствуют надежные методы их предсказания. Ожидается, что вирусные анти-рестрикционные белки существуют для большинства недавно обнаруженных систем защиты от фагов, и этот пробел можно частично заполнить с помощью функциональной метагеномики. В рамках проекта будут созданы плазмидные библиотеки, несущие ген устойчивости к антибиотику и вставки вирусной метагеномной ДНК. Библиотеки будут использованы для трансформации бактериальных клеток с защитной системой, нацеленной на плазмиду. Эффективное таргетирование библиотеки со стороны клетки-хозяина приведет к выживанию на селективной среде только клеток, содержащих плазмидные варианты, обогащенные анти-рестрикционными белками. Этот подход позволит обнаружить новые ингибиторы систем защиты хозяина и дополнит описание разнообразия систем защиты в популяции.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сутормин Д., Галивонджан А., Мушарова О., Травин Д., Русанова А., Образцова К., Борухов С., Северинов К. Interaction between transcribing RNA polymerase and topoisomerase I prevents R-loop formation in E. coli Nature Communications, 13(1), 4524 (год публикации - 2022)
10.1038/s41467-022-32106-5

2. Ширяева А.А., Кузнеделов К., Федоров И.А., Мушарова О.С., Хвостиков Т.С., Цой Ю., Курилович Е.А., Смит Д.Р., Семенова Е., Северинов К.В. Host nucleases generate prespacers for primed adaptation in the E. coli type I-E CRISPR-Cas system Science Advances, Vol 8, Issue 47 (год публикации - 2022)
10.1126/sciadv.abn8650

3. Исаев А., Андреянов А., Знобищева Е., Зорин Е., Морозова Н., Северинов К. Editing of Phage Genomes—Recombineering-assisted SpCas9 Modification of Model Coliphages T7, T5, and T3 Molecular Biology, Vol. 56, No. 6, pp. 801–815 (год публикации - 2022)
10.1134/S0026893322060073

4. Кудрявцева А.А., Цефалви Е., Гнучих Е. Ю., Яновская Д. Д., Скутель М. А., Исаев А. Б., Баженов С. В., Уткина А. А., Манухов И. В. Broadness and specificity: ArdB, ArdA, and Ocr against various restriction-modification systems Frontiers in Microbiology, выпуск 14 (год публикации - 2023)
10.3389/fmicb.2023.1133144

5. Kelly A et al. Diverse Durham collection phages demonstrate complex BREX defense responses Applied and Environmental Microbiology, выпуск 89, том 9 (год публикации - 2023)
10.1128/aem.00623-23

6. Андриянов А., Тригуис С., Дробязко А., Сьерро Н., Иванов Н.В., Сельмер М., Северинов К., Исаев А. Phage T3 overcomes the BREX defense through SAM cleavage and inhibition of SAM synthesis by SAM lyase Cell Reports, Том 42, Выпуск 8 (год публикации - 2023)
10.1016/j.celrep.2023.112972

7. Р.Г. Аксенов, А.В. Комиссарова, М.А. Скутель, А.Б. Исаев Анализ геномных вариантов клеток Escherichia coli К-12, устойчивых к инфекции фагом Т7 Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств», выпуск 2(56) (год публикации - 2023)
10.17586/2310-1164-2023-16-2-3-12

8. Михаил Скутель, Александр Андриянов, Мария Завьялова, Мария Кирсанова, Олувасефунми Шодунке, Евгений Зорин, Александр Головщинский, Константин Северинов, Артём Исаев T5-like phage BF23 evades host-mediated DNA restriction and methylation microLife, 4, 1–15 (год публикации - 2023)
10.1093/femsml/uqad044

9. Демкина А., Слонова Д., Мамонтов В., Коновалова О., Юрикова Д., Рогожин В., Белова В., Коростин Д., Сутормин Д., Северинов К., Исаев А. Benchmarking DNA isolation methods for marine metagenomics Scientific Reports, 13(1):22138 (год публикации - 2023)
10.1038/s41598-023-48804-z

10. Скутель М., Яновская Д., Демкина А., Шенфельд А., Мушарова О., Северинов К., Исаев А. RecA-dependent or independent recombination of plasmid DNA generates a conflict with the host EcoKI immunity by launching restriction alleviation Nucleic Acids Research, Том 52, Выпуск 9, Стр. 5195–5208 (год публикации - 2024)
10.1093/nar/gkae243

11. Бурман Н, Белухина С, Депардье Ф, Уилкинсон Р.А., Скутель М, Сантьяго-Франгос А, Грэм А.Б., Ливенский А, Чеченина А, Морозова Н, Заль Т, Энрикес В.С., Бююкёрук М, Руйон С, Саудемон Б, Широкова Л, Курата Т, Гаврилюк В, Северинов К, Грозей Ж, Тьерри А, Кошуль Р, Тессон Ф, Бернхайм А, Бикард Д, Виденхефт Б, Исаев А. A virally encoded tRNA neutralizes the PARIS antiviral defence system Nature, 634(8033):424-431 (год публикации - 2024)
10.1038/s41586-024-07874-3

12. Ярема П., Котовская О., Скутель М., Дробязко А., Моисеенко А., Соколова О., Самитова А., Коростин Д., Северинов К., Исаев А. Sxt1, Isolated from a Therapeutic Phage Cocktail, Is a Broader Host Range Relative of the Phage T3 Viruses, Viruses 2024, 16(12), 1905 (год публикации - 2024)
10.3390/v16121905

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На третьем году реализации проекта мы проводили исследования по нескольким направлениям, объединенным тематикой взаимодействия систем бактериального иммунитета и вирусных противозащитных белков. Наиболее значительным достижением является определение механизма обнаружения и ингибирования фаговой инфекции абортивными системами иммунитета PARIS. Установлено, что PARIS состоит из сенсора фаговой инфекции ABC ATPase AriA и эффектора нуклеазы TOPRIM AriB. Связывание вирусного триггера, ДНК-имитирующего белка Ocr, с сенсором AriA приводит к высвобождению эффектора AriB из комплекса AriAB и димеризации эффектора. Активированный AriB ингибирует трансляцию посредством расщепления бактериальной лизиновой тРНК. Более того, мы определили, что некоторые фаги могут преодолевать иммунитет PARIS, поскольку они кодируют нерасщепляемые аналоги тРНК. Этот результат проливает свет на старую загадку роли генов тРНК, кодируемых вирусами. Такие тРНК как анти иммунные агенты замещают тРНК хозяина, поврежденную абортивной нуклеазой, что поддерживает вирусную инфекцию. Другим важным результатом является определение механизма ингибирования инфекции фага лямбда новой антисмысловой РНК, происходящей из ori репликации фага. Мы показали, что эта анти-O РНК, комплементарная O мРНК, ингибирует продукцию O белка и приводит к дестабилизации O мРНК по зависимому от Hfq механизму. Нами впервые была получена карта позиций начала транскрипции фага лямбда во время литического развития и в лизогенном состоянии, которая выявила новые смысловые и антисмысловые промоторы, требующие дальнейшего изучения. Результаты также подтвердили, что анти-O РНК продуцируется фагом лямбда в ходе его развития и, таким образом, может выполнять регуляторную роль. Наконец, мы раскрыли антирестрикционный механизм, ранее связанный с геном ardD, кодируемым неконъюгативными транспозонами. Продемонстрировано, что локусы ardD могут быть полностью удалены без потери антирестрикционной функции и что антирестрикционный эффект опосредован самой ДНК. Полученные результаты свидетельствуют, что плазмиды, несущие сайты рекомбинации Chi и сайты системы рестрикции-модификации EcoKI типа I, могут запускать механизмы аллевиации рестрикции — зависимое от протеазы ClXP устранение расщепление HsdR субьединицы EcoKI системы. Обычно этот механизм защищает бактериальные хромосомы от атаки системы EcoKI в условиях, когда в ДНК хозяина появляются неметилированные сайты EcoKI. Нам удалось показать, что присутствие плазмидной ДНК в нормальных условиях может запуксать схожий механизм, что приводит к отключению EcoKI защиты.

Публикации