Исследование структурной организации толл-подобных рецепторов и их сигнальных комплексов по данным ЯМР-спектроскопии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00020

НазваниеИсследование структурной организации толл-подобных рецепторов и их сигнальных комплексов по данным ЯМР-спектроскопии

Руководитель Арсеньев Александр Сергеевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова толл-подобные рецепторы, толл-интерлейкин подобный домен, мембранный белок, структура, ЯМР-спектроскопия, мембраноподобные среды, TIR, TLR, бесклеточная продукция, белковая инженерия, трансмембранный домен, липодиски, MyD88, TIRAP

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одной из важнейших задач современной биологии является выяснение механизмов работы различных белков не на уровне взаимодействий между молекулами, а на уровне пространственной структуры. Такие данные необходимы для рациональной инженерии белков с заданными свойствами, а также для разработки новых лекарственных средств. Особенный интерес в этой связи представляют мембранные белки, в частности, клеточные рецепторы, которые участвуют во множестве процессов жизнедеятельности клетки. Несмотря на свою очевидную важность, на сегодняшний день пространственная структура мембранных белков остается малоизученной. Основной научной проблемой, на решение которой направлен настоящий Проект, является выяснение механизмов функционирования сигнальных систем Толл-подобных рецепторов (TLR) на уровне пространственной структуры отдельных белков и их комплексов. TLR являются ключевыми участниками системы врожденного иммунитета. Активация TLR приводит к развитию иммунного ответа и воспаления, рецепторы семейства вовлечены в развитие ряда заболеваний, в том числе сепсиса, иммунодефицита, атеросклероза и астмы. Это делает TLR перспективными мишенями для разработки лекарственных средств направленного действия, более двадцати новых лекарств, воздействующих на TLR, уже сейчас находятся на различных фазах клинических испытаний. Несмотря на кажущуюся ясность, в области структурной биологии толл-подобных рецепторов осталось много неотвеченных вопросов. Так, не получены структуры TIR доменов шести представителей семейства, не описаны интерфейсы гомо- и гетеродимеризации TIR доменов для всех рецепторов семейства, кроме TLR10. Не изучены структуры комплексов между TIR доменами TLR и адаптерными белками, неясна структурная организация трансмембранных доменов и примембранных регионов большинства TLR. Не изучено структурное влияние доменов друг на друга в составе полноразмерного рецептора. В рамках Проекта предлагается заполнить большинство из перечисленных пробелов в структурной биологии TLR: исследовать структуру TIR доменов TLR в растворе, определить пространственные структуры трансмембранных доменов ряда TLR, изучить взаимодействия TIR доменов с ионами цинка, а также их внутримолекулярную подвижность. Планируется локализовать интерфейсы димеризации TIR доменов TLR, а также интерфейсы взаимодействия между TIR доменами TLR и адаптерными белками MyD88 и TIRAP. Изучить влияние димеризации TLR на взаимодействия их внутриклеточных доменов с адаптерными белками. Коллектив Проекта для исследования пространственных структур белков применяет метод спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Данный метод имеет свои ограничения, преимущества и недостатки. Из преимуществ можно выделить возможность изучать поведение объектов исследования в растворе, при физиологических параметрах окружающей среды, при этом можно исследовать не только структуру, но и подвижность отдельных участков молекулы белка, что является важной информацией для изучения функционирования клеточных рецепторов. С другой стороны, существует необходимость мечения объектов исследования стабильными изотопами азота и углерода, а мембранные белки необходимо помещать в специализированное мембраноподобное окружение. Узким местом большинства таких исследований является получение изотопно-меченых препаратов белков в нативно свернутом состоянии. Решению данной проблемы в отношении внутриклеточных и трансмембранных доменов TLR и будет посвящена важная часть Проекта - будут разработаны подходы к получению внутриклеточных и трансмембранных доменов ряда TLR в нативном состоянии в бактериальных системах продукции, будут разрабатываться новые типы мембраноподобных сред на основе липодисков для обеспечения адекватного окружения. Наконец, на протяжении всего Проекта будет вестись разработка методов получения белковых конструкций, содержащих внутриклеточные и мембранные домены TLR. При этом, планируется использовать самые передовые технологии белкового лигирования и сегментного изотопного мечения. Таким образом, коллектив Проекта планирует получение важных результатов как в области белковой инженерии (разработка технологий продукции мембранных белков), так и в области структурной биологии (получение недостающей информации о структуре белков, участников сигнальных каскадов TLR). Все результаты работы будут оригинальными и не будут иметь мировых аналогов, работы будут выполнены на самом современном оборудовании с использованием недавних методов белковой инженерии и многомерной гетероядерной спектроскопии ЯМР в растворе и опубликованы в рецензируемых международных журналах.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Корнилов ФД, Шабалкина АВ, Лин С, Волынский ПЕ, Кот ЭФ, Каюшин АЛ, Лушпа ВА, Гончарук МВ, Арсеньев АС, Гончарук СА, Ван Х, Минеев КС The architecture of transmembrane and cytoplasmic juxtamembrane regions of Toll-like receptors Nature Communications, Kornilov, F.D., Shabalkina, A.V., Lin, C. et al. The architecture of transmembrane and cytoplasmic juxtamembrane regions of Toll-like receptors. Nat Commun 14, 1503 (2023). (год публикации - 2023)
10.1038/s41467-023-37042-6

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Толл-подобные рецепторы (TLR) являются ключевыми участниками системы врожденного иммунитета и могут выступать мишенями для новых лекарственных препаратов против ряда заболеваний, в том числе онкологических. Это массивные мембранные белки, которые характеризуются объемными внеклеточными и внутриклеточными частями, в то время как их трансмембранная часть представлена одной гидрофобной альфа-спиралью. Исследование структуры TLR и их сигнальных комплексов необходимо для понимания фундаментальных принципов их функционирования и возможности таргетной рациональной разработки лекарственных препаратов. В рамках Проекта планировалось изучить структуру трансмембранной части, примембранных регионов и внутриклеточных доменов ряда толл-подобных рецепторов, а также их взаимодействия с адаптерными белками. В отчетном году работа по проекту велась в нескольких направлениях. По направлению, посвященному продукции TIR-доменов, были разработаны протоколы получения укороченного варианта внутриклеточного домена рецептора TLR4. Было показано, что удаление С-концевого фрагмента повышает растворимость белка в клетках бактерии при его синтезе, что подтверждает высказанную ранее гипотезу о влиянии неструктурированных участков на накопление растворимой фракции. По направлению, посвященному исследованию структуры трансмембранных доменов TLR (ТМД TLR), было изучено влияние холестерина и толщины мембранного бислоя на структуру фрагментов TLR1 и TLR2, содержащих трансмембранные домены и примембранные регионы. Показано, что никаких существенных изменений при изменении толщины бислоя или добавлении холестерина не происходит. По направлению, посвященному исследованию взаимодействий TLR и адаптерных белков с ионами цинка, была изучена способность TIR домена рецептора TLR2 связывать цинк. Показано, что белок взаимодействует с цинком и определены ключевые остатки, участвующие в связывании. По направлению, посвященному исследованию белок-белковых взаимодействий TIR доменов, была разработана методика получения индуцированного димера TLR1 и TLR2, и изучены взаимодействия между TIR доменами белков TLR1, TLR2, TIRAP и MyD88, а также влияние цинка на эти процессы. По направлению, посвященному получению нативно свернутых белков, содержащих ТМ и внутриклеточные домены TLR, был проведен подбор условий лигирования фрагментов рецептора TLR1, а также очистки целевого продукта. Показано, что данный подход позволяет получить фрагмент рецептора, содержащий трансмембранный и внутриклеточный домены. По направлению, посвященному разработке мембраноподобных сред на основе SMA, были проведены исследования липодисков на основе полимеров SMA-EA и SMA-tau, полученных на предыдущих этапах Проекта, а также коммерчески-доступного полимера SMA-EA. Показано, что синтезированные в ходе работы полимеры позволяют проводить сборку липодисков как из липосом, так и из клеточных мембран и могут быть использованы для солюбилизации мембранных белков. Таким образом, проведенные исследования и полученные результаты являются уникальными и соответствуют современному мировому уровню.

Публикации

1. Кислова С, Мотов В, Мяснянко И, Пыцкий И, Гончарук С, Болдырев И Conformational transitions of maleic acid segment drive pH induced changes in SMA polymer structure and solubility Journal of Molecular Liquids, Volume 398, 15 March 2024, 124302 (год публикации - 2024)
10.1016/j.molliq.2024.124302

2. Лушпа В.А., Гончарук М.В., Талызина И.А., Арсеньев А.С., Бочаров Е.В., Минеев К.С., Гончарук С.А. TIR domains of TLR family-from the cell culture to the protein sample for structural studies Plos One, 2024, 19(7):e0304997 (год публикации - 2024)
10.1371/journal.pone.0304997

3. Влияние неструктурированных участков на экспрессию TIR доменов толл-подобных рецепторов в растворимом виде Влияние неструктурированных участков на экспрессию TIR доменов толл-подобных рецепторов в растворимом виде Биоорганическая химия (год публикации - 2024)

4. Мотов В.В., Кот Е.Ф., Кислова С.О., Бочаров Е.В., Арсеньев А.С., Болдырев И.А., Гончарук С.А., Минеев К.С. On the Properties of Styrene–Maleic Acid Copolymer–Lipid Nanoparticles: A Solution NMR Perspective Polymers, Polymers 2024, 16(21), 3009 (год публикации - 2024)
10.3390/polym16213009

5. Внутриклеточный домен TLR2 способен связывать Zn с высокой аффинностью: возможные пути активации рецептора. The intracellular domain of TLR2 is capable of high-affinity Zn binding: possible outcomes for the receptor activation FEBS Letters, https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1873-3468.70026 (год публикации - 2025)
10.1002/1873-3468.70026

Возможность практического использования результатов
В рамках Проекта было получено несколько важных результатов, которые могут найти отражение в практике. Одним из таких результатов является установленный факт, что TIR домены TLR1 и TLR2 способны связывать ионы цинка с высокой аффинностью и конкурировать за него. При этом ключевую роль в этих взаимодействиях играют цистеины. Эти данные могут быть использованы для поиска и/или разработки препаратов, нацеленных на регуляцию иммунного ответа. Следующей важной находкой является внутриклеточный примембранный регион TLR. Оказалось, что он представляет собой не просто линкер, соединяющий трансмембранный и TIR домены рецепторов, но и является полноценным функциональным элементом. Это делает его потенциальной мишенью для лекарственных препаратов.