Исследование эффектов изменений уровней рибосомных белков, ассоциированных с гепатоцeллюлярной карциномой, на экспрессию генов в клетках человека и анализ их белковых партнеров

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00039

НазваниеИсследование эффектов изменений уровней рибосомных белков, ассоциированных с гепатоцeллюлярной карциномой, на экспрессию генов в клетках человека и анализ их белковых партнеров

Руководитель Малыгин Алексей Аркадьевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова Рибосомные белки, ассоциированные с гепатоцeллюлярной карциномой человека; клетки HEK293T и HepG2; нокдаун мРНК рибосомных белков; продукция рибосомных белков с мутациями по сайтам убиквитинилирования; высокопроизводительное секвенирование РНК; полисомный профайлинг; коиммунопреципитация белков; внутриклеточное белок-белковое сшивание; регуляция экспрессии генов; дифференциально экспрессируемые гены; гены с дифференциальной трансляционной эффективностью; белки-партнеры рибосомных белков

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В последнее время появляется всё больше данных, свидетельствующих о том, что рибосомные белки способны модулировать экспрессию большого числа генов, вовлечённых в метаболические пути, связанные с ростом клеток, их дифференциацией, апоптозом и канцерогенезом, т.е. обладают регуляторными функциями. Изменения в уровнях рибосомных белков, вызванные нарушениями экспрессии их генов, связывают с развитием и прогрессированием различных форм рака, хотя роль самих белков в эволюции конкретных типов опухолей остается непонятой. Методы высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq), позволяют изучать ранее неисследованные специфические функции рибосомных белков, имеющие отношению к раку, на уровне клеток. С помощью этих методов может быть выявлен полный спектр изменений в экспрессии генов на транскрипционном и трансляционном уровнях, индуцируемых дефицитом или гиперпродукцией любого рибосомного белка. Получение такой информации о рибосомных белках, связанных с заболеваниями человека, обеспечило бы понимание того, как их клеточный дисбаланс влияет на регуляцию экспрессии конкретных генов и как избыток или дефицит белков, кодируемых этими генами, вызывает нарушения в работе органов и систем, дисфункция которых приводит к развитию патологических процессов. Настоящий проект направлен на исследование изменений в транскриптомах и транслятомах нормальных и опухолевых клеток, индуцируемых дефицитом или избытком рибосомных белков uS5 (S2), eS6 (S6), uS8 (S15A), eL36 (L36), eL42 (L36A) и RACK1, ассоциированных с гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК), и на выявление их белковых партнеров. Для решения этих задач будут использованы такие методы, как RNA-seq и полисомный профайлинг с последующим RNA-seq, и методы, основанные на коиммунопреципитации взаимодействующих белков и внутриклеточном белок-белковом сшивании с последующим масс-спектрометрическим анализом, соответственно. Решение первой задачи подразумевает определение наборов генов со статистически значимыми изменениями в экспрессии на транскрипционном и трансляционном уровнях вместе с наборами генов с измененной трансляционной эффективностью для каждого из вышеперечисленных рибосомных белков в ответ на его дефицит в клетках HEK293T и HepG2. Планируется также выполнить аналогичное исследование для каждого из белков uS5, uS8, eL36 и eL42 с клетками HEK293T и HepG2, продуцирующими FLAG-меченые белки с мутациями по сайтам убиквитинилирования, и с клетками, продуцирующими соответствующие белки дикого типа. Ожидается, что рибосомные белки с заменами по указанным сайтам будут нарабатываться в клетках в избыточных количествах по сравнению с белками дикого типа. Установление генов, чья экспрессия и трансляционные эффективности зависят от клеточных уровней ГЦК-ассоциированных рибосомных белков, позволит выявить процессы и пути, в которых задействованы белки, кодируемые этими генами. Решение второй задачи предполагает идентификацию клеточных белков-партнеров для каждого из рибосомных белков uS5, uS8, eL36 и eL42 в клетках HEK293T и HepG2, продуцирующих соответствующие FLAG-меченые белки дикого типа или с мутациями по сайтам убиквитинилирования. Сравнительный анализ полученных данных позволит выявить возможные различия во взаимодействиях этих белков между нормальными и опухолевыми клетками в зависимости от уровней этих белков. В совокупности решение поставленных задач позволит определить ключевые механизмы, посредством которых изменения в уровнях вышеуказанных рибосомных белков могли бы приводить к развитию и прогрессированию ГЦК. Таким образом, исследование специфических функций рибосомных белков, ассоциированных с ГЦК, в клетках HEK293T и HepG2 с помощью вышеуказанных методов, даст новую информацию о способах регуляции многих важнейших метаболических путей, в которых участвуют продукты генов, чья экспрессия и трансляционная эффективность зависит от уровней этих белков. Кроме того, эта информация прольет свет на возможную связь между избыточными уровнями отдельных рибосомных белков, например, uS5 и eL42, компонентов функциональных центров рибосом, и селективной трансляцией мРНК специфических генов, которая могла бы иметь место при ГЦК.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Малыгин А.А. Many Faces of Next-Generation Sequencing in Gene Expression Studies. International Journal of Molecular Sciences, 24(4):4075 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24044075

2. Золотёнкова Е.А., Гопаненко А.В., Тупикин А.Е., Кабилов М.Р., Малыгин А.А. Mutation at the Site of Hydroxylation in the Ribosomal Protein uL15 (RPL27a) Causes Specific Changes in the Repertoire of mRNAs Translated in Mammalian Cells. International Journal of Molecular Sciences, 24(7):6173 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24076173

3. Очкасова А., Арбузов П., Малыгин А., Грайфер Д. Two "Edges" in Our Knowledge on the Functions of Ribosomal Proteins: The Revealed Contributions of Their Regions to Translation Mechanisms and the Issues of Their Extracellular Transport by Exosomes International Journal of Molecular Sciences, 24(14):11458 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241411458

4. Тянь Ю., Бабайлова Е.С., Гопаненко А.В., Тупикин А.В., Кабилов М.Р., Малыгин А.А. Deficiency of the ribosomal protein uS10 (RPS20) reorganizes human cells translatome according to the abundance, CDS length, and GC content of mRNAs Open Biology, Open Biol. 14: 230366 (год публикации - 2024)
10.1098/rsob.230366

5. Бабайлова Е.С., Гопаненко А.С., Тупикин А.Е., Кабилов М.Р., Малыгин А.А. The intrinsic properties of mRNAs define their translation efficiency at ribosome shortage Nucleic Acids Research, 2025; V 53, N 19, gkaf1013 (год публикации - 2025)
10.1093/nar/gkaf1013

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Рибосомные белки являются мажорными клеточными белками, основной функцией которых является формирование функционально-компетентной структуры рибосомы – основного участника процесса трансляции (биосинтеза белка). Повреждение генов рибосомных белков приводит к их клеточной недостаточности и ассоциировано с рядом наследственных заболеваний; кроме того, часто в раковых клетках выявляют мутации в генах различных рибосомных белков и связывают их с развитием онкологических заболеваний и агрессивностью опухолей. Мы показали, что дефицит обязательного для структуры рибосомы рибосомного белка еS26 приводит к снижению общего уровня рибосом. Мы изучили, как отличается состав набора мРНК, транслируемых на рибосомах, в клетках с дефицитом еS26 от набора мРНК в нормальных клетках и установили, что при недостатке рибосом уровень транслируемых мРНК изменяется в соответствии с их физическими характеристиками. Чем длиннее кодирующая часть мРНК, ниже содержание в ней остатков G и C и выше её общее содержание – тем более эффективно данная мРНК транслируется в таких клетках при недостатке рибосом и наоборот. Мы установили, что такое правило вытекает из уравнения мРНК-рибосомного баланса, которое справедливо для всех типов клеток, и показали, что снижение эффективности трансляции мРНК гена GATA1 – ключевого фактора эритропоэза, нарушение экспрессии которого является причиной лейкемии при недостаточности рибосомных белков, также подчиняется этому правилу. Вместе с тем, мы установили, что дефицит необязательного для структуры рибосомы рибосомного белка RACK1 вызывает другие изменения в наборе транслируемых мРНК и имеет иные последствия для клеток, то есть, эффекты изменения эффективности трансляции мРНК при дефиците рибосмного белка зависят от его способности встраиваться в состав рибосом. Применяя различные подходы для увеличения уровня отдельных рибосомных белков в клетках, мы установили, что нельзя выборочно увеличить уровень обязательного рибосомного белка в клетках относительно остальных рибосомных белков. Мы выяснили, что устоявшееся в научной литературе мнение о том, что при тех или иных заболеваниях и особенно при различных видах злокачественной трансформации клеток повышается уровень какого-либо отдельного рибосомного белка основано на не корректной интерпретации авторами своих данных. Исследуя контакты рибосомного белка eL36 в клетках с помощью химического сшивания, мы показали, что этот белок контактирует с его соседями в составе рибосомы и её комплексов, а не как свободный белок. Это позволило нам выдвинуть гипотезу, что внерибосомные функции рибосомных белков – в принципе достаточно редкое явление, и соматические мутации в генах рибосомных белков, часто наблюдаемые в раковых клетках, могут сказываться негативным образом именно на рибосомных функциях этих белков, искажая транслятом клеток и вызывая их злокачественную трансформацию.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут составить научный задел для биотехнологических компаний в плане направленного поиска онкомаркёров и разработки новых технологий борьбы отдельными видами онкологических заболеваний и рибосомопатий.