Роль гомеостаза цистеина при стрессовом ответе у бактерий

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00093

НазваниеРоль гомеостаза цистеина при стрессовом ответе у бактерий

Руководитель Смирнова Галина Васильевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук , Пермский край

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова Цистеин, глутатион, H2S, ионы железа, антибиотики, стрессовый ответ, активные формы кислорода

Код ГРНТИ34.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Фундаментальная научная проблема, на решение которой направлен проект, заключается в изучении механизмов гомеостаза цистеина как потенциально опасного источника радикалов при различных стрессах, включая действие антибиотиков. Благодаря высокой редокс-активности своей SH-группы, цистеин может восстанавливать внутриклеточные ионы Fe3+ до Fe2+, что в присутствии Н2О2 потенцирует протекание реакции Фентона с образованием гидроксильных радикалов, которые вызывают окислительное повреждение всех клеточных макромолекул. Для предотвращения этих негативных явлений клетки должны осуществлять строгий регуляторный контроль и поддерживать низкие уровни Н2О2, свободного железа и цистеина при различных переходных процессах, связанных с изменением условий окружающей среды. К числу важнейших путей регуляции уровня цистеина у Escherichia coli, наряду с синтезом, относятся его транспорт, включение в состав менее подверженного окислению глутатиона и деградация с образованием H2S. Большинство грамположительных бактерий не содержат глутатион, но имеют другие резервные формы цистеина, включая бациллитиол у Bacillus subtilis и микотиол у Mycobacterium smegmatis. В настоящее время вклад каждого из путей поддержания гомеостаза цистеина, а также общие и специфические механизмы его регуляции при различных стрессах у бактерий разных видов недостаточно изучены. В этой связи изучение изменений трансмембранных потоков цистеина, глутатиона и сульфида и их регуляции представляет большой интерес для понимания процессов адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды. Особый интерес проблема поддержания гомеостаза цистеина представляет в связи с активно дебатируемой гипотезой группы Коллинза об окислительном стрессе как едином механизме летальной активности бактерицидных антибиотиков. Имеющиеся в литературе данные о вкладе радикалов в бактерицидную активность носят противоречивый характер, что может быть во многом связано с различием условий культивирования, в частности с использованием сред с разным содержанием экзогенного цистеина и железа и с отсутствием строго контроля скорости роста бактерий, которая определяет число активных мишеней для антибиотиков. В ходе выполнения проекта планируется изучить, как присутствие экзогенного цистеина и изменение содержания ионов железа в среде влияют на поддержание внутриклеточного гомеостаза цистеина, на характер стрессового ответа и на чувствительность бактерий E. coli к действию бактерицидных (ципрофлоксацин) и бактериостатических (хлорамфеникол) антибиотиков. Также планируется изучить, как нарушения путей гомеостаза цистеина у мутантов по системам экспорта и деградации цистеина влияют на толерантность к антибиотикам на средах с разным содержанием цистеина и железа. Выявить среди путей поддержания гомеостаза цистеина наиболее перспективные мишени для повышения эффективности антибиотиков. Показать универсальность механизмов регуляции гомеостаза цистеина с участием его экспорта, деградации и включения в резервные депо при различных стрессах (стрессы голода и действие антибиотиков) у бактерий разных видов. Одним из главных преимуществ нашего подхода к решению поставленных задач является постоянный контроль скорости роста и “real-time” мониторинг физиологических параметров культуры непосредственно в колбах, где осуществляется культивирование, путем непрерывной регистрации уровня кислорода (рО2), рН, редокс-потенциала (Eh), концентрации К+, сульфида и Fe3+ с использованием системы электродов и оригинального аппаратно-программного комплекса. Другим преимуществом является комплексный характер исследований. Данные о метаболическом состоянии культур, полученные с помощью селективных электродов, будут подтверждены результатами биохимических анализов, включая определение АТФ, пула NAD+-NADH, мембранного потенциала (Δψ), концентрации Fe2+ и Fe3+ в среде, продукции H2S в газовой фазе над поверхностью культуры. Для характеристики редокс-ситуации с использованием высокоспецифичных чувствительных методов будут определяться уровни активных форм кислорода, цистеина, глутатиона и других небелковых тиолов внутри и снаружи клеток. При исследовании вклада различных механизмов в поддержание гомеостаза цистеина будут использованы делеционные мутанты из коллекции Keio. Будет также оцениваться экспрессия генов katG, katE, sodA, sulA и iucC, принадлежащих к OxyR, RpoS, SoxRS, SOS и Fur регулонам соответственно, что позволит судить об изменениях уровней оксидантов и концентрации железа, а также о наличии взаимосвязи между путями гомеостаза цистеина и активностью этих регулонов. Бактерицидная активность антибиотиков будет определяться путем проведения тестов на способность к образованию колоний (КОЕ) и окрашиванию SITO 9 и йодидом пропидия (“live/dead”). Руководитель и участники проекта владеют всеми перечисленными методами и имеют большой опыт исследований в области изучения роли низкомолекулярных тиолов при стрессах и стрессового ответа бактерий на действие бактерицидных и бактериостатических антибиотиков. Лаборатория, в которой планируется выполнение проекта, обеспечена помещениями, современными приборами и вспомогательным оборудованием, соответствующим поставленным задачам и в количестве, достаточном для выполнения проекта. В настоящее время лаборатория обладает приоритетом в обнаружении феномена образования H2S и повышения GSH как механизма регуляции уровня цистеина при стрессовом ответе бактерий на факторы, ингибирующие синтез белка. В ходе выполнения проекта будут получены новые знания о роли механизмов гомеостаза цистеина при других стрессах и у других видов бактерий. Изучение роли регуляции уровня цистеина при действии антибиотиков на разных средах может быть ключевым фактором для разрешения имеющихся противоречий относительно вклада окислительного стресса в механизм летальности.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тюленев А.В., Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Октябрьский О.Н. Study of the effect of protein synthesis inhibitors on growing Escherichia coli bacteria using electrochemical sensors Acta Biomedica Scientifica, Том 7, № 5-1, С. 110-118 (год публикации - 2022)
10.29413/ABS.2022-7.5-1.12

2. Безматерных К.В., Тюленев А.В., Калашникова Т.В., Ушаков В.Ю., Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ НА ГОМЕОСТАЗ ЦИСТЕИНА У ESCHERICHIA COLI ПРИ ДЕЙСТВИИ ХЛОРАМФЕНИКОЛА Актуальные аспекты современной микробиологии: XIII молодежная школа-конференция с международным участием. Москва, 16–18 ноября 2022 г. – М. : ВАШ ФОРМАТ, 2022. – 286 с., С. 27-29 (год публикации - 2022)

3. Тюленев А.В., Смирнова Г.В., Габова А.О., Октябрьский О.Н. ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ АЭРОБНОРАСТУЩИХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ПРИ СТРЕССЕ ГОЛОДА ПО СУЛЬФАТУ Актуальные аспекты современной микробиологии: XIII молодежная школа-конференция с международным участием. Москва, 16–18 ноября 2022 г. – М. : ВАШ ФОРМАТ, 2022. – 286 с., С. 262-262 (год публикации - 2022)

4. Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Музыка Н.Г., Ушаков В.Ю., Самойлова З.Ю., Октябрьский О.Н. Influence of growth medium composition on physiological responses of Escherichia coli to the action of chloramphenicol and ciprofloxacin BioTech (Basel), BioTech, 2023, 12(2), 43 (год публикации - 2023)
10.3390/biotech12020043

5. Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Безматерных К.В., Музыка Н.Г., Ушаков В.Ю., Октябрьский О.Н. Phosphate starvation is accompanied by disturbance of intracellular cysteine homeostasis in Escherichia coli Research in Microbiology, Research in Microbiology 2023, V. 174, N8, 104108 (год публикации - 2023)
10.1016/j.resmic.2023.104108

6. Тюленев А.В., Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Самойлова З.Ю., Октябрьский О.Н. Changes in Physiological Parameters of Escherichia coli During Antibiotic-Induced Stress Response Lecture Notes in Networks and Systems, LNNS, 622, 530–538 (год публикации - 2023)
10.1007/978-3-031-28086-3_48

7. Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Музыка Н.Г., Сутормина Л.В., Октябрьский О.Н. Изменения активности антиоксидантных систем Escherichia coli при фосфатном голодании Молекулярная биология, Молекулярная биология, 2023, том 57, № 6, с. 965–978 (год публикации - 2023)
10.31857/S0026898423060198

8. Сутормина Л.В., Безматерных К.В., Музыка Н.Г., Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Нарушение гомеостаза цистеина при действии ципрофлоксацина на Escherichia coli Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2023, Том 176, № 12 (год публикации - 2023)
10.47056/0365-9615-2023-176-11-

9. Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Сутормина Л.В., Калашникова Т.В., Самойлова З.Ю., Музыка Н.Г., Ушаков В.Ю., Октябрьский О.Н. Effect of H2S and cysteine homeostasis disturbance on ciprofloxacin sensitivity of Escherichia coli in cystine-free and cystine-fed minimal medium Archives of Microbiology , V. 206. P. 456 (год публикации - 2024)
10.1007/s00203-024-04185-z

10. Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Сутормина Л.В., Калашникова Т.В., Музыка Н.Г., Ушаков В.Ю., Самойлова З.Ю., Октябрьский О.Н. Regulation of cysteine homeostasis and its effect on Escherichia coli sensitivity to ciprofloxacin in LB medium International Journal of Molecular Sciences , V. 25. P. 4424 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25084424

11. Тюленев А.В., Смирнова Г.В., Ушаков В.Ю., Калашникова Т.В., Сутормина Л.В., Октябрьский О.Н. Stress-induced sulfide production by Bacillus subtilis and Bacillus megaterium Microorganisms, V. 12. P. 1856 (год публикации - 2024)
10.3390/microorganisms12091856

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Ранее мы показали, что ингибирование синтеза белка при действии валина или хлорамфеникола на E. coli приводит к появлению избытка внутриклеточного цистеина и активирует механизмы его гомеостаза, включая генерацию H2S, повышение уровня GSH и экспорт цистеина в среду (Tyulenev et al. 2018, doi: 10.1016/j.bioelechem.2017.12.012; Smirnova et al. 2019, doi: 10.1046/j.1365-2958.2000.01924.x). Повышение внутриклеточной концентрации цистеина потенциально опасно, поскольку из-за своей высокой редокс-активности цистеин может служить источником ROS в реакциях аутоокисления, а также выступать в качестве восстановителя железа, способствуя протеканию реакции Фентона с образованием токсичных гидроксильных радикалов (Park, Imlay 2003, doi: 10.1128/JB.185.6.1942-1950.2003; Korshunov et al. 2020, doi: 10.1111/mmi.14403). Метаболическая перестройка при многих стрессах сопряжена с резким ингибированием роста клеток, что создает условия для появления избыточного цистеина при сокращении его расходов на синтез белка. Мы предположили, что индукция механизмов цистеинового гомеостаза является частью универсального ответа бактерий на различные стрессовые воздействия. Для проверки этой гипотезы были изучены изменения уровней низкомолекулярных тиолов при голодании E. coli по фосфату, аммонию и сульфату. Универсальность механизмов гомеостаза цистеина для разных видов бактерий проверялась с использованием, наряду с E. coli, грамположительных видов Bacillus subtilis, Bacillus megaterium и Mycobacterium smegmatis, у которых исследовались стрессы голода и действие антибиотиков. Все эксперименты проводились в аэробных условиях на минимальной среде с сульфатом при строгом контроле физиологических параметров бактериальных культур. Мониторинг содержания растворенного кислорода, рН и уровня К+ и сульфида осуществляли с использованием электрохимических сенсоров непосредственно в колбах с растущей культурой. Для определения цистеина применялся метод Gaitonde, глутатион измеряли циклическим методом Tietze с DTNB и глутатионредуктазой. Кроме того, содержание всех низкомолекулярных тиолов, включая бациллитиол и микотиол, определяли методом ВЭЖХ в виде производных монобромбимана. Было установлено, что истощение глюкозы, фосфата и аммония, а также действие хлорамфеникола, ципрофлоксацина и ряда других антибиотиков на все изученные виды бактерий сопровождалось появлением избытка цистеина, который включался в буферные молекулы глутатиона (GSH) или микотиола (MSH), экспортировался в среду и частично деградировал с образованием H2S. Повышение концентрации внутриклеточного цистеина регистрировалось у E. coli при голодании по фосфату (в 1.75 раза) и аммонию (в 2 раза), у B. subtilis – при голодании по глюкозе (в 1.3 раза), у M. smegmatis – в 1.6 раза при действии хлорамфеникола (Cam) и ципрофлоксацина (CF). Одновременно во всех изученных ситуациях в 2–4 раза возрастала концентрация цистеина в среде, что свидетельствует об увеличении его экспорта из клеток. Основная часть избыточного цистеина у E. coli встраивалась в GSH, внутриклеточный уровень которого при голодании по аммонию и фосфату увеличивался в 2.5 и 3 раза. Концентрация бациллитиола (BSH), который рассматривается как возможный буфер цистеина у B. subtilis, не показала значительных изменений при голодании этих бактерий по азоту и при действии Cam и CF. Уровень BSH не возрастал и в ответ на добавление цистина, который создает переизбыток цистеина в клетках за счет импорта цистина и его восстановления в цистеин. Это указывает на низкую эффективность BSH как буфера цистеина. MSH у M. smegmatis, напротив, проявлял высокие буферные качества, при добавлении цистина его уровень повышался в 50-100 раз, а при обработке хлорамфениколом в 2 раза по сравнению с контролем. Хорошим маркером нарушения гомеостаза цистеина было появление сульфида в среде, регистрируемое платиновым (Eh) и сульфидным электродами как быстрое снижение потенциала (скачок), который затем постепенно возвращался к базовому уровню у E. coli или имел необратимый характер, как у B. subtilis. Начало выделения сульфида совпадало с резким торможением роста и дыхания, ингибированием потребления глюкозы и K+ и снижением мембранного потенциала. Количество сульфида, продуцируемого клетками, зависело от типа стресса и вида бактерий и варьировало от 10-30 nM у M. smegmatis при действии Cam и CF до 1.35 μM при обработке Cam бактерий B. subtilis. Клетки B. subtilis выделяли больше H2S в течение более длительного времени, чем остальные изученные виды, что, по-видимому, объясняется отсутствием эффективного буфера цистеина у этих бактерий. Такая же ситуация наблюдалась у gshA мутанта E. coli, лишенного GSH. В отличие от E. coli и Bacillus, у M. smegmatis продукция сульфида при перестройке метаболизма, связанной с действием антибиотиков, могла быть зарегистрирована только благодаря мониторингу с использованием высокочувствительного сульфидного электрода. Причиной более слабого ответа на стресс у этой бактерии может быть ее низкая скорость роста, при которой воздействие антибиотиков не приводило к резкой остановке синтеза белка. Активация механизмов цистеинового гомеостаза при стрессах способствовала постепенному снижению концентрации внутриклеточного цистеина до уровней, характерных для растущей культуры. Несмотря на повышение продукции супероксида и активацию окислительных процессов в клетках, восстановление гомеостаза цистеина в совокупности с усилением антиоксидантной защиты путем индукции каталаз и снижение уровня свободного железа позволяло клеткам E. coli предупредить окислительное повреждение ДНК при голодании по фосфату. Добавление фосфата, аммония и глюкозы к клеткам, голодающим по этим субстратам, сопровождалось быстрым возобновлением роста и возвращением к норме всех изучаемых параметров, включая уровни внутриклеточных тиолов и продукцию H2S. В отличие от других стрессов, торможение роста и метаболизма при исчерпании сульфата у E. coli не сопровождалось повышением уровня цистеина и продукцией H2S, содержание GSH снижалось до нуля. Добавление источника серы (Na2SO4 или цистина) к голодающим клеткам индуцировало выделение сульфида и повышение концентрации GSH, свидетельствуя о появлении избытка внутриклеточного цистеина. Таким образом, полученные данные подтверждают нашу гипотезу о том, что метаболическое перепрограммирование бактериальных клеток при стрессах сопровождается появлением избыточного цистеина и активацией механизмов его гомеостаза. Активация этих механизмов является частью универсального ответа при различных стрессах у бактерий разных видов и обеспечивает защиту от окислительного повреждения и сохранение жизнеспособности бактерий в меняющихся условиях среды.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Углубленное изучение адаптивных реакций бактерий на действие неблагоприятных факторов, в том числе антимикробных препаратов, необходимо при поиске адъювантов, повышающих эффективность существующих антибиотиков, и при создании новых лекарственных средств. Одним из направлений, активно развивающихся в последние годы, является изучение роли цистеина и его производных как факторов, влияющих на вирулентность бактерий и их чувствительность к окислительному стрессу и антибиотикам. Результаты, полученные нами в ходе выполнения проекта, являются важным вкладом в эту область исследований, поскольку впервые показано, что действие антибиотиков нарушает гомеостаз внутриклеточного цистеина и вызывает активацию механизмов его восстановления, которые могут стать мишенями при поиске новых антибиотиков.