Рациональный дизайн целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков с новыми свойствами с использованием методов мутагенеза и молекулярного моделирования

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00125

НазваниеРациональный дизайн целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков с новыми свойствами с использованием методов мутагенеза и молекулярного моделирования

Руководитель Высоцкий Евгений Степанович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" , Красноярский край

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика

Ключевые слова целентеразин, люцифераза, фотопротеин, структура и функция белков

Код ГРНТИ34.17.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Биолюминесценция – широко распространенное природное явление. Светящиеся организмы встречаются среди бактерий, грибов, простейших, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и рыб. Хотя эти организмы стоят на разных ступенях эволюции, природа свечения одинакова. Фактически, биолюминесценция – это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстрата – люциферина, катализируемое специфическим ферментом – люциферазой. Люциферины и люциферазы разных организмов – соединения различной структуры и поэтому это, скорее, собирательное и функциональное понятие, чем структурно-химическое. Неослабевающее внимание исследователей к изучению биолюминесценции отчасти объясняется желанием понять молекулярный механизм функционирования конкретных биолюминесцентных белков из различных организмов, и установить общие закономерности, лежащие в основе конверсии энергии химических связей субстрата в свет видимого диапазона, происходящей при участии белков. Но все-таки основной движущей силой, определяющей интерес к изучению биолюминесценции, является возможность создания высокочувствительных аналитических систем на основе биолюминесцентных белков для применения в медицинской диагностике и визуализации внутриклеточных процессов in vivo на уровне клетки и целого организма. Среди нескольких люциферинов, идентифицированных в морских организмах, наиболее широко распространен целентеразин. Целентеразин идентифицирован как субстрат биолюминесцентной реакции в радиоляриях, ктенофорах, кишечнополостных, копеподах, некоторых рыбах, а также, вполне вероятно, он является субстратом и во многих других, еще неисследованных светящихся организмах. Однако, несмотря на использование одного и того же субстрата и идентичный химический механизм его окисления, белки, катализирующие целентеразин-зависимые биолюминесцентные реакции, отличаются поразительным разнообразием. В настоящее время среди этих биолюминесцентных белков изучена лишь малая часть, что не позволяет сделать обобщающих заключений о сходстве и разнообразии их структурно-функциональной организации. Несмотря на имеющиеся недостатки, целентеразин-зависимые биолюминесцентные белки широко применяются в качестве репортерных молекул в исследованиях в области экспериментальной медицины и клеточной биологии. В рамках данного проекта планируется сконструировать целентеразин-зависимые биолюминесцентные белки с улучшенными репортерными свойствами, такими как, например, смещенный в область более высоких температур оптимум биолюминесцентной реакции, повышенная термостабильность, смещенный в длинноволновую область спектр излучения, увеличенная специфическая биолюминесцентная активность. Для достижения этих целей планируется использовать методы сайт-направленного и случайного мутагенеза, а также методы компьютерного моделирования. Такой подход очень перспективен, поскольку в последнее время достигнут существенный прогресс в области предсказания и анализа пространственных структур белков с использованием методов глубокого машинного обучения, включая подход AlphaFold, и применения предобученных лингвистических моделей. Применение методов машинного обучения в комбинации с методами молекулярного моделирования позволит выявить аминокислотные остатки, физико-химические и конформационные характеристики целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков, модулирующие их биолюминесцентные свойства, и построить компьютерные модели для предсказания аминокислотных замен, целенаправленно меняющих эти свойства. Сочетание теоретических и экспериментальных методов позволит не только сконструировать биолюминесцентные белки с улучшенными репортерными свойствами для аналитических применений in vivo и in vitro (или даже de novo сконструировать «искусственные» целентеразин-зависимые люциферазы и фотопротеины), но и позволит получить новые знания о структурно-функциональной организации целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков, включая функциональную роль аминокислотных остатков в каталитическом окислении целентеразина и формировании эмиттера у разного типа этих белков.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Буракова Л.П., Колмакова А.А., Высоцкий Е.С. Recombinant light-sensitive photoprotein berovin from ctenophore Beroe abyssicola: Bioluminescence and absorbance characteristics Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 624, p. 23-27 (год публикации - 2022)
10.1016/j.bbrc.2022.07.079

2. Наташин П.В., Высоцкий Е.С. Can Ca2+-regulated photoproteins perform different functions than bioluminescence? BIOINFORMATICS OF GENOME REGULATION AND STRUCTURE/SYSTEMS BIOLOGY (BGRS/SB-2022), Abstracts the Thirteenth International Multiconference, Novosibirsk, Russia, BGRS/SB-2022 307 - BGRS/SB-2022 308 (год публикации - 2022)
10.18699/BGRS/SB-2022-000

3. Высоцкий Е.С. Bioluminescent and Fluorescent Proteins: Molecular Mechanisms and Modern Applications International Journal of Molecular Sciences, No.1, Vol.24, P.281 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24010281

4. Наташин П.В., Буракова Л.П., Ковалева М.И., Шевцов М.Б., Дмитриева Д.А., Еремеева Е.В., Маркова С.В., Мишин А.В., Борщевский В.И., Высоцкий Е.С. The Role of Tyr-His-Trp Triad and Water Molecule Near the N1-Atom of 2-Hydroperoxycoelenterazine in Bioluminescence of Hydromedusan Photoproteins: Structural and Mutagenesis Study International Journal of Molecular Sciences, No.7, Vol.24, P.6869 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24076869

5. Буракова Л., Иванисенко Н., Высоцкий Е. ФОТОСТАБИЛЬНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФОТОПРОТЕИН БЕРОВИН С ОПТИМУМОМ АКТИВАЦИИ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Материалы X Съезда Российского фотобиологического общества. Конференция «Современные проблемы фотобиологии». пос. Шепси Краснодарского края 10 – 17 сентября 2023 г., стр. 203-204 (год публикации - 2023)

6. Наташин П., Иванисенко Н., Буракова Л., Иванисенко В., Высоцкий Е. СТРУКТУРНЫЕ ГОМОЛОГИ СА2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ. СПОСОБЕН ЛИ АПОФОТОПРОТЕИН ВЫПОЛНЯТЬ ФУНКЦИИ, НЕ СВЯЗАННЫЕ С ИЗЛУЧЕНИЕМ СВЕТА? Материалы X СЪЕЗДА РОССИЙСКОГО ФОТОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА. КОНФЕРЕНЦИЯ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ФОТОБИОЛОГИИ» пос. Шепси Краснодарского края 10 – 17 сентября 2023 г., стр.205-206 (год публикации - 2023)

7. Еремеева Е., Гульнов Д., Немцева Е., Буракова Л., Петушков В., Высоцкий Е. КИНЕТИЧЕСКИЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОДУКТОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ РЕАКЦИИ CA2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ – ЦЕЛЕНТЕРАМИДА И ЦЕЛЕНТЕРАМИНА Материалы X СЪЕЗДА РОССИЙСКОГО ФОТОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА. КОНФЕРЕНЦИЯ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ФОТОБИОЛОГИИ» пос. Шепси Краснодарского края 10 – 17 сентября 2023 г., стр. 209-210 (год публикации - 2023)

8. Ларионова М., Иванисенко Н., Иванисенко В., Буракова Л., Наташин П., Еремеева Е., Высоцкий Е. РАЦИОНАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ЛЮЦИФЕРАЗЫ RENILLA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Материалы X СЪЕЗДА РОССИЙСКОГО ФОТОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА. КОНФЕРЕНЦИЯ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ФОТОБИОЛОГИИ» пос. Шепси Краснодарского края 10 – 17 сентября 2023 г., стр. 219-220 (год публикации - 2023)

9. Наташин П., Еремеева Е., Шевцов М., Ковалева М., Дмитриева Д., Мишин А., Борщевский В., Высоцкий Е. ЦЕЛЕНТЕРАМИН КАК ОСНОВНОЙ ПРОДУКТ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ РЕАКЦИИ: СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы X СЪЕЗДА РОССИЙСКОГО ФОТОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА. КОНФЕРЕНЦИЯ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ФОТОБИОЛОГИИ» пос. Шепси Краснодарского края 10 – 17 сентября 2023 г., стр. 224-225 (год публикации - 2023)

10. Наташин П.В., Еремеева Е.В.,Шевцов М.Б., Ковалева М.И., Бухдрукер С.С., Дмитреева Д.А., Гульнов Д.В., Немцева Е.В., Горделий В.И., Мишин А.В., Борщевский В.И., Высоцкий Е.С. Crystal structure of semi-synthetic obelin-v after calcium induced bioluminescence implies coelenteramine as the main reaction product Scientific Repots, 12(1):19613 (год публикации - 2022)
10.1038/s41598-022-24117-5

11. Иванисенко В.А., Буракова Л.П., Еремеева Е.В., Наташин П.В., Ларионова М.Д., Маликова Н.П., Иванисенко Т.В., Деменков П.С., Вензель А.С., Иванисенко Н.В., Высоцкий Е.С. PhotoProteinTech database on the properties of luciferases and Ca2+-regulated photoproteins, technologies and areas of their application created by automatic analysis of scientific publications and patents Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология: Четырнадцатая международная мультиконференция : Тез. докл. (Россия, Новосибирск, 5–10 авг. 2024 г.) / Ин-т цитологии и генетики СО РАН; Новосиб. нац. исслед. гос. ун-т. – Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2024, стр. 593-594 (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-3.1-39

12. Буракова Л.П., Маркова С.В., Маликова Н.П., Высоцкий Е.С. Expression, Purification, and Determination of Sensitivity to Calcium Ions of Ctenophore Photoproteins Methods in Molecular Biology, 2757:269-287 (год публикации - 2024)
10.1007/978-1-0716-3642-8_12

13. Бураккова Л.П., Иванисенко Н.В., Рукосуева Н.В., Иванисенко В.А., Высоцкий Е.С. Design of Ctenophore Ca2+-Regulated Photoprotein Berovin Capable of Being Converted into Active Protein Under Physiological Conditions: Computational and Experimental Approaches Life (Basel), 14, 1508 (год публикации - 2024)
10.3390/life14111508

14. Буракова Л.П., Иванисенко Н.В., Рукосуева Н.В., Иванисенко В.А., Высоцкий Е.С. Предсказание влияния замены отдельных аминокислотных остатков беровина, Са2+-регулируемого фотопротеина ктенофор, на условия его активации in vitro Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология: Четырнадцатая международная мультиконференция : Тез. докл. , стр. 460-464 (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-3.1-03

15. Ларионова М.Д., Иванисенко Н.В., Иванисенко В.А., Буракова Л.П., Наташин П.В., Еремеева Е.В., Высоцкий Е.С. Совершенствование репортерных свойств люциферазы Renilla с использованием методов молекулярного моделирования Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология: Четырнадцатая международная мультиконференция : Тез. докл. (Россия, Новосибирск, 5–10 авг. 2024 г.) / Ин-т цитологии и генетики СО РАН; Новосиб. нац. исслед. гос. ун-т. – Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, стр. 496-499 (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-3.1-11

16. Ларионова М. Д., Иванисенко Н. В., Иванисенко В. А., Буракова Л. П., Наташин П. В., Еремеева Е. В., Высоцкий Е. С. Рациональная оптимизация последовательности люциферазы Renilla с использованием подходов обратного фолдинга Современные вызовы структурной и синтетической биологии. Материалы все- российской школы-конференции. Шерегеш, 3–7 апреля 2024 г. – Новосибирск. ООО «Офсет-ТМ». 2024., стр. 36 (год публикации - 2024)

17. Наташин Р.В., Ларионова М.Д., Шевцов М.Б., Ву Л., Буракова Л.П., Ковалева М.И., Петушков В.Н., Еремеева Е.В., Дмитреева Д.А., Лю Д., Мишин А.В., Лю Д., Борщевский В.И., Высоцкий Е.с. Crystal structures of obelin with coelenterazine-v before and after light emission confirm coelenterazine dioxyethanone decomposition through ‘light’ and ‘dark’ pathways Biomembranes 2024, International Conference, Book Abstracts, 7-11 October 2024, Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University), Dolgoprudny, стр. 48 (год публикации - 2024)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Согласно плану 2024 г., за отчетный период получены мутанты «желтой» люциферазы из Renilla muelleri (RmY) с заменами Lys189: K189C, K189N, K189E, K189M и K189V, а также мутант K189Q люциферазы Rm7, предшественника мутантной люциферазы RmY. Все мутантные варианты получены с помощью сайт-направленного мутагенеза на плазмиде с His-tag, геном мальтоза-связывающего белка (MBP) и сайтом узнавания TEV-протеазы. Рекомбинантные белки экспрессированы в клетках E. coli и выделены в высокоочищенном виде по протоколу, подобранному ранее для мутантов RmY. Для всех полученных мутантов были измерены температурные оптимумы реакции (23–32°С). Значимым результатом является то, что мутант K189M сохранял 90% своей биолюминесцентной активности при 37°С. Внесение одиночной мутации K189Q в последовательность Rm7 не привело, вопреки ожиданиям, к повышению температурного оптимума, как это произошло для RmY. По всей вероятности, эффект повышения температурного оптимума от замены K189Q достигается только в сочетании с уже имеющимися в RmY заменами. Также была исследована температурная стабильность – способность белка сохранять биолюминесцентную активность после кратковременной инкубации при повышенной температуре. Показано, что инкубация новых мутантов при 50°C в течение 5 минут приводит к сохранению не более 20% исходной активности, в то время как K189Q демонстрировал значительно большую температурную стабильность, сохраняя 52% биолюминесцентной активности. Биолюминесцентную активность измеряли двумя способами: по максимальной величине сигнала и по интегральному свету, собранному в течение 15 минут, измерены спектральные характеристики мутантов. Среди всех исследованных мутантов большая часть демонстрировала ускорение реакции биолюминесценции с CTZ, за исключением мутанта K189V. Таким образом, в ходе выполнения проекта было всесторонне исследовано влияние замены аминокислотных остатков в положении 189 люциферазы Renilla, что позволило получить мутанты с повышенной биолюминесцентной активностью и повышенной термостабильностью. Показано, что внесение мутации K189V в RmY приводит к замедлению кинетики биолюминесценции и к увеличению интегрального сигнала. Одиночная замена K189Q способствует повышению как термостабильности, так и удельной биолюминесцентной активности RmY. Внесение аналогичной мутации в последовательность Rm7 приводит к повышению интегрального и максимального сигналов в 3,5 и 1,4 раза, соответственно, что делает данный мутант перспективным для применения в аналитических приложениях. С помощью пакета AlphaFold в OpenFold были предсказаны различные конформационные состояния структуры беровина. Для выявления аминокислот, ответственных за превращение апо-беровина в его активную форму, модель апо-беровина была наложена на кристаллическую структуру активного акворина (PDB 1EJ3). Модель показала заметные различия в аминокислотном составе сайтов связывания целентеразина у беровина и акворина. Предполагаемый сайт связывания субстрата в беровине не содержит гистидинов, которые в фотопротеинах гидромедуз участвуют в стабилизации 2-гидропероксицелентеразина, его декарбоксилировании и формировании эмиттера, поэтому было предположено, что кластер Lys90/Asn107 может быть ответственным за конверсию апо-беровина в активную форму при щелочном pH. Для изучения роли Lys90 и Asn107 в конверсии апо-беровина в активную форму была создана серия мутантов: K90A/W103F/N107S, K90A/W103Y/N107S, K90M/W103F/N107S, K90M/W103Y/N107S и K90M/W103F/N107V. Для всех мутантов были оценены оптимальные условия активации, биолюминесцентная активность, выход белка, измерены кажущиеся константы диссоциации (Kd), спектры биолюминесценции и флуоресценции. При этом корреляция между Kd и выходом белка не установлена. По-видимому, на формирование фотопротеинового комплекса помимо сродства к субстрату может влиять и ряд других факторов, например, стабильность комплекса. Все тройные мутанты были менее чувствительны к свету и более термостабильны, чем беровин дикого типа. Комбинация мутаций K90M/W103F/N107S оказалась наиболее подходящей для образования фотопротеинового комплекса при физиологических условиях. Несмотря на то, что получить мутанты с высокой активностью не удалось, выявление Lys90 как ключевого остатка, определяющего сдвиг оптимума активации беровина в щелочные условия, является значимым результатом. Также Met был идентифицирован в качестве адекватного замещения Lys90 для обратного сдвига.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В ходе выполнения проекта был получен мутант люциферазы Renilla K189Q, обладающий повышенной биолюминесцентной активностью и термостабильностью, оптимумом биолюминесценции при 37°С и излучением в желтой области спектра. Данный мутант может быть использован в качестве репортерного биолюминесцентного белка в методах высокопроизводительного скрининга для первичного отбора химических соединений фармацевтическими компаниями, занимающимися созданием новых лекарственных препаратов, а также в исследованиях в области клеточной биологии и экспериментальной медицины для визуализации in vivo различных внутриклеточных процессов.