Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект посвящен разработке и применению инновационного подхода LiveMIEL для исследования эпигенетических модификаций гистонов в живых клетках на уровне единичных экземпляров. Работа включала в себя создание генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров, позволяющие визуализировать распределение эпигенетических маркеров в живых клетках. LiveMIEL использует количественный анализ изображений, классифицируя клетки в зависимости от их эпигенетического состояния, что обеспечивает детальную картину изменений в хроматине. С помощью этого подхода мы исследовали эпигенетические изменения, происходящие во время дифференцировки индуцированных стволовых клеток человека (иПСК, iPSC) в нейрональные клетки. В рамках проекта получены стабильные клеточные линии iPSC-TetOn-NGN2, экспрессирующие флуоресцентные сенсоры MPP8-mNeonGreen-MPP8, AF9-Katushka и PWWP-Katushka, для визуализации эпигенетических модификаций H3K9me3, H3K9ac и H3K36me2/3, соответственно. Для индукции дифференцировки иПСК в нейрональные клетки использовалась система Tet-On-NGN2, где добавление доксициклина вызывает экспрессию транскрипционного фактора NGN2 и старт дифференцировки. Клеточная линия была предоставлена коллегами и полностью охарактеризована. Каждая линия была трансдуцирована сенсорами для визуализации эпигенетических маркеров. После добавления доксициклина иПСК были индуцированы к дифференцировке, и в течение четырех дней наблюдали изменения в хроматине. Через четыре дня клетки начали приобретать нейрональную морфологию с длинными отростками. Специфичность дифференцировки клеток, индуцированных NGN2, была подтверждена непрямым иммунофлюоресцентным анализом с антителами против TUBB3 и MAP2. Прижизненная флуоресцентная микроскопия позволила исследовать динамику эпигенетических изменений в процессе дифференцировки. В каждом моменте времени (на протяжении 4 дней, с записью данных 1 раз в сутки) мы фиксировали 10-30 случайно выбранных полей зрения для каждого из эпигенетических маркеров (H3K9me3, H3K9ac, H3K36me2/3). Полученные изображения анализировались с помощью предложенного нами подхода LiveMIEL, который включает сегментацию ядер, выделение количественных метрик распределения сенсоров в ядрах, а также последующую кластеризацию данных. Кластеризация позволила выявить следующие ключевые моменты ремоделинга хроматина: для H3K9me3 выделено две волны реорганизации хроматина, 0-2 дня и 3-4 дня, отражающие динамику эпигенетических изменений; для H3K9ac выделено три ключевых этапа эпигенетических изменений. Начальное состояние (0 дней) сменяется активным этапом на 1–3 дни, после чего следует завершение глобальной перестройки на 4-й день дифференцировки. Мы выделяем две важнейшие временные точки ремоделинга хроматина: начало активации транскрипционных процессов в первый день и стабилизацию на завершающем этапе на 4-й день. Кластеризация данных для H3K36me2/3 выявила пять волн, каждая из которых отражает уникальный этап дифференцировки. Динамичность уровня H3K36me2/3 на протяжении всего эксперимента указывает на важную роль данной модификации в поддержании активного ремоделинга хроматина в дифференцировке. Для дальнейшего исследования динамики движения локусов, обогащенных определенными эпигенетическими модификациями, был проведен эксперимент с 40-секундными видео, записанными с использованием наших флуоресцентных сенсоров. Показано, что паттерн флуоресцентных “точек” H3K9me3 сохраняет свое положение, что подтверждает роль этой модификации в сохранении структуры гетерохроматина. Паттерны H3K9ac продемонстрировали наибольшую подвижность в секундной шкале времени, вероятно отражая высокую динамичность локусов с активной транскрипцией. H3K36me3 показал незначительные, но постоянные изменения в ландшафте, подтверждающие умеренную динамику в процессе дифференцировки. Для подтверждения успешности дифференцировки провели РНК-секвенирование на клетках, индуцированных с использованием фактора ATOH1. Биоинформатический анализ показал, что сенсор MPP8-mNeonGreen-MPP8 не оказывает значимого воздействия на транскриптом иПСК. При дифференцировке наблюдалось снижение экспрессии генов плюрипотентности и активация нейрональных генов, что подтверждает успешную активацию нейрональной. Использование разработанных сенсоров позволило детально изучить динамику эпигенетических изменений, ассоциированных с H3K9me3, H3K9ac и H3K36me2/3 в процессе дифференцировки иПСК по нейрональному пути. Результаты подтверждают важность эпигенетических перестроек для успешной активации нейрональной программы и служат основой для дальнейших исследований, направленных на углубленное понимание эпигенетической регуляции нейрогенеза. В 2024 году наши результаты были опубликованы в нескольких международных журналах. В журнале Cellular and Molecular Life Sciences вышла статья «Tracking induced pluripotent stem cell differentiation with a fluorescent genetically encoded epigenetic probe», посвящённая изучению динамики H3K9me3 во время дифференцировки иПСК под воздействием ATOH1[10], https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39222083/. Она включает как результаты 2023 года, так и дополнительные эксперименты 2024 года, такие как вычисление Kd сенсора MPP8-mNeonGreen-MPP8, транскриптомный анализ, а также анализ эпигенетического ландшафта иПСК в первые 24 часа после индукции дифференцировки методом цейтраферной (time-lapse) съемки с почасовым разрешением. Вторая публикация вышла в журнале Biochemical and Biophysical Research Communications [11], «Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells», вышла в журнале Biochemical and Biophysical Research Communications [11], https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39317113/. Она описывает разработку сенсоров на основе белка Katushka (MPP8-Katushka, AF9-Katushka, DPF3-Katushka) для визуализации гистоновых модификаций, а также анализ эпигенетического ландшафта с использованием платформы LiveMIEL. Результаты подтвердили независимость и специфичность созданных сенсоров. Кроме того, две статьи [12,13] приняты в печать в журнале Биоорганическая химия. "Визуализация H3K9me3 в эмбриоидных тельцах с помощью генетически кодируемого флуоресцентного сенсора MPP8-Green", где демонстрируется гетерогенное распределение H3K9me3 в эмбриоидных тельцах. "Применение бимолекулярной флуоресцентной комплементации для визуализации гистоновых модификаций в живых клетках", где описывает использование splitFAST, причём в этом году были выполнены дополнительные эксперименты по характеристике сенсора с использованием LiveMIEL.