Сравнительный анализ возрастных сигнатур у долго- и короткоживущих представителей Heterocephalus glaber: каст-специфичность поведенческих, биохимических и транскриптомных профилей

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00160

НазваниеСравнительный анализ возрастных сигнатур у долго- и короткоживущих представителей Heterocephalus glaber: каст-специфичность поведенческих, биохимических и транскриптомных профилей

Руководитель Высоких Михаил Юрьевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые слова голый землекоп, старение, специализация, эусоциальность, изоляция, стресс, митохондрии, AGE, воспаление, АФК, кардиолипин

Код ГРНТИ34.03.27

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Голый землекоп(Heterocephalus glaber) - один из немногих по-настоящему эусоциальных млекопитающих (Jarvis, 1981) и единственный, у кого есть морфологически разные касты (O’Rian et al. 1996, 2000). Колонии голых землекопов содержат одну самку (королева) и 1-3 самца (паша), которые обладают повышенной продолжительностью жизни по сравнению с не размножающимися рабочими обоих полов как в неволе, так и в дикой природе (Ruby et al. 2018, Hochberg et al. 2016 ). Принадлежность к касте зависит от социальных и экологических факторов и является обратимой (Jarvis 1981). К настоящему времени эти небольшие грызуны стали важным модельным объектом в современной биологии вследствие их устойчивости к гипоксии, болезням и раку, а также необычайной продолжительности жизни - более 30 лет (Austad 2009; de Malgahaes et al. 2007, Edrey et al. 2011). Тем не менее, их кастовая система все еще плохо изучена и редко учитывается в исследованиях, несмотря на ее потенциально большое влияние на результаты исследования и интерпретацию. Недавно нами было обнаружено, что одна из каст, ранее описанная различными исследователями (сведения предоставлены д-ром Хильдебрандом в рамках персональной коммуникации) как няньки молодых особей, после специфической физической нагрузки демонстрирует яркий фенотип ускоренного старения, при этом другие представители этих поколений соответствуют возрастной норме при тех же условиях. Мы предлагем провести сравнительный анализ поведения, морфологии органов, метаболических особенностей и транскриптомных отличий для выявленной касты короткоживущих голых землекопов в сравнении с их долгоживущими братьями и сестрами из соответствующих пометов. Кроме того, идентификация касты короткоживущих голых землекопов предоставляет нам уникальную возможность изучить молекулярные основы поведенческой, морфологической и физиологической пластичности у представителей одного и того же вида. Таким образом, мы ставим себе целью изучить физиологические, транскриптомные и биохимические особенности , лежащие в основе кастовой системы голых землекопов с акцентом на выяснение природы отличий, приводящих представителей выявленной касты к укороченной продолжительности жизни (до 5 лет), а также обнаруженной у них манифестации таких маркеров старения как саркопения, дисфункция почек и печени, дистрофия сердечной мышцы, а также накопление в коже продуктов глубокого гликирования белков и др. Используя долгосрочное видеонаблюдение в сочетании с индивидуальной системой слежения чипированных животных и системы шлюзов в гнезде, мы будем наблюдать за поведением, движениями и характером активности отдельных животных известного возраста, а также проводить измерение массы тела и оценивать состояния гонад. Для постоянного мониторинга физиологических параметров будут использоваться внутрибрюшные регистраторы данных для контроля локомоторной активности и температуры тела в отобранных группах коротко- и долгоживущих животных. Критерием отбора будет набор параметров, ранее определенный нами как позволяющий достоверно идентифицировать короткоживущую касту – накопление продуктов глубокого гликирования белков в коже и динамика изменения веса тела. Образцы органов отобранных представителей короткоживущей касты и идентичных им долгоживущих собратьев того же помета будут проанализированы на предмет транскриптомных, морфологических различий и разницы энергетического метаболизма. Изучение механизмов, с помощью которых представители одного помета могут иметь кратные различия в продолжительности жизни, позволит сделать важные выводы о регулировании продолжительности жизни и старения у млекопитающих в целом.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Аверина О.А., Адрианов М.А., Пермяков О.А., Шкавро Н.Н., Высоких М.Ю. Специфика содержания голых землекопов (Heterocephalus glaber) в лабораторных условиях ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ (год публикации - 2022)
10.57034/2618723X-2022-04-05

2. Аверина О.А., Адрианов М.А., Бобров М.Ю., Манухова Л.А., Марей М.В., Пермяков О.А., Рачкова А.А., Эльдаров Ч.М., Шкавро Н.Н., Скулачев В.П., Высоких М.Ю. ОСОБЕННОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ 2 С МИТОХОНДРИЯМИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ДОЛГОЖИВУЩЕГО ГРЫЗУНА HETEROCEPHALUS GLABER Биохимия (год публикации - 2022)

3. Высоких М.Ю., Виговский М.А., Марей М.В., Григорьева О.А., Филиппов В.В., Бородай Я.Р., Вепхвадзе Т.Ф., Курочкина Н.С., Манухова Л.А., Ефименко А.Ю., Попов Д.В., Скулачев В.П. ПЕРИФЕРИЧЕСКИЕ КИНАЗЫ МИТОХОНДРИЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ЧЕЛОВЕКА И ДОЛГОЖИВУЩЕГО ГРЫЗУНА HETEROCEPHALUS GLABER ПРИ СТАРЕНИИ Сборник тезисов XXIV съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, СПб.: Изд-во ВВМ, Сборник тезисов XXIV съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Санкт-Петербург, С23, Под общ. ред. член-корр. РАН, д. б. н. М.Л. Фирсова. – СПб.: УДК 612 ББК 28.9 С23, Изд-во ВВМ, 2023. –612 с. , ISBN 978-5-9651-1500-6, стр.238 (год публикации - 2023)

4. М.А.Адрианов, М.Ю.Бобров, И.З. Мамедов, В.Н.Манских, А.А.Рачкова, А.М. Шелехова, Ч.М.Эльдаров, О.А.Аверина, М.Ю.Высоких Повышенная физическая нагрузка в условиях нормоксии вызывает идиопатическую кахексию у Heterocephalus glaber Bulletin of Russian State Medical University (год публикации - 2024)

5. Высоких М.Ю. Возраст-зависимый контроль продукции митохондриальных активных форм кислорода при сопряжении креатинкиназной реакции и окислительного фосфорилирования в скелетной мышце долго- и короткоживущих видов В сборнике Морфология - Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, издательство ООО «Эко-Вектор» (Санкт-Петербург), 2024, В сборнике Морфология - Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, издательство ООО «Эко-Вектор» (Санкт-Петербург), 2024, с. 198-199 (год публикации - 2024)
10.17816/morph.konf2024

6. Адрианов М.А., Бобров М., Мамедов И., Манских В., Шеваль Е.В., Рачкова А.А., Шелехова А.М., Эльдаров С.М., Аверина О.А., Высоких М.Ю. A set of microRNAs are differentially expressed in cachectic naked mole rat colony members after chronic heavy burden under normoxia Biochimie (год публикации - 2024)

7. Высоких М.Ю., Аверина О.А. , Адрианов М.А. , Виговский М.А. , Филиппов В.В. , Бородай Я.Р. , Марей М.В. , Григорьева О.А. , Вепхвадзе Т.Ф. , Курочкина Н.С. , Манухова Л.А. , Ефименко А.Ю. , Попов Д.В. , Скулачев В.П. Age-dependentcontrol of mitochondrial reactive oxygenspecies production during coupling of creatine kinase reaction and oxidative phosphorylation in skeletal muscle of long and short living species Морфология - Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, издательство ООО «Эко-Вектор» (Санкт-Петербург), 2024, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, издательство ООО «Эко-Вектор» (Санкт-Петербург), 2024, с. 198-199 (год публикации - 2024)
10.17816/morph.konf2024

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетный период были поставлены эксперимент по двум схемам – по схеме 1 для индукции кахексичного состояния у особей.Через два месяца цель была достигнута – в колонии номер 1 появились 7 кахексичных особей (2 самки, 5 самцов), которые достоверно снизили индекс массы тела по сравнению с другими членами колонии того же помета и температуру тела с 30,5 до 26,9°С. Для второй колонии предполагалось проведение аналогичного исследования на фоне диетарной поддержки животных антиоксидантом направленного действия SkQ1 (пластомитин) в дозе 50мг\кг массы тела. Однако, в ходе предварительных экспериментов по исследованию стабильности пластомитина в желудке голых землекопов было выяснено, что как полученный в виде добавки к корму (пропитанное мясо), так и введённый при помощи зонда, пластомитин в минутной шкале разлагается в желудке и в связи с этим не попадает в кровь животного. При этом, в составе корма или раствора для зондового введения, пластомитин деградировал в течение суток не более, чем на 30% в диапазоне температур от 20 до 40°С. В связи с отсутствием разработок назального препарата пластомитина, а также большими техническими сложностями именно для этого животного с подобным введением вследствие его анатомических особенностей было принято решение подобный эксперимент не проводить и использовать более стабильный водный раствор N-ацетилцистеина (doi.org/10.1080/03602532.2020.1832112). Однако, оказалось, что для данного вещества не удается достигнуть терапевтических концентраций300мг/кг– интраперитонеальное введение в таких дозах вызывало воспаление, в двух случаях закончившееся гибелью животного. Диетарное введение было также неудачным, поскольку животные не ели корм, пропитанный веществом в такой дозировке. В связи с вышеизложенными обстоятельствами, данный эксперимент был отложен до отработки методических подходов, позволивших бы его корректное выполнение. Таким образом, мы сконцентрировались на эксперименте по схеме 1. - После окончания опыта отсек с глиной был отсоединен и вся колония получила свободный доступ к еде. Далее, после 2 месяцев было выявлено, что кахексичные животные не набирают потерянный вес и по прежнему имеют температуру тела около 27°С, несмотря на неограниченный доступ к еде и агрессивное пищевое поведение. Был проведен слепой отбор 3 животных (1 самка и два самца) и рандомизированный подбор соответствующих по полу и возрасту животных для группы сравнения. После анестезии изофлюраном были собраны образцы ткани сердца, почки, печени, скелетной мышцы, селезенки, яичника и мозга для последующих анализов гистологии, биохимических исследований, выделения РНК и подготовки библиотек для последующего анализа транскриптома. Все пробы для молекулярных исследований были разделены на две части, из одной части были выделены митохондрии по вышеописанным методикам и аликвочены на 2 части, ткань для работы с РНК была заморожена сразу после извлечения– пробы для выделения РНК были доставлены в Университет Сириус. При хранении образцов тканей в НИИФХБ произошло отключение электричества, размораживание и утрата части образцов. Оставшиеся пробы были использована для ограниченной серии исследования окислительных модификаций белков (карбинилирования), исследование ацетилирования были отменены и перенесены на следующий эксперимент. Для исследования ультраструктуры митохондрий скелетных мышц животных опытной группы (кахексичные животные) и группы сравнения были приготовлены препараты для проведения электронной микроскопии. Для этого образцы тканей фиксировали по стандартной методике, для ориентации образцов изготавливали полутонкие срезы (2-3 мкм), идентифицировали участки с продольной ориентацией мышечных волокон, с которых потом получали серийные ультратонкие срезы (90-150 нм). Срезы контрастировали 5% водным уранилацетатом и цитратом свинца и фотографировали в просвечивающий электронный микроскоп JEM-1400 (JEOL, Япония), регистрировали на CCD-камеру QUEMESA (Olympus, Япония) при увеличении 5000х. Для прослеживания длинных митохондрий регистрировали серии перекрывающихся полей зрения для создания панорам. Трехмерную реконструкцию осуществляли с помощью программного пакета IMOD, совмещение серийных срезов осуществляли при помощи анализа кросс-корреляции с последующим уточнением по алгоритму Midas. После создания и наложения объемных моделей на изображения одиночных срезов было установлено взаиморасположение митохондрий и структуры миофибрилл. Полученные данные полностью соответствуют современным моделям строения митохондриальной сети в скелетной мышце [doi: 10.1113/JP286246] и представлены на рис.2а. Подобные структуры встречаются реже для образцов ткани скелетных мышц, полученных от кахексичных животных – снижается число контактов между субсарколеммальной фракцией и интермиофибриллярной, происходит разрушение системы транспорта мембранного потенциала вглубь волокна от периферии рис.2б. Заметим, что подобные наблюдения также подтверждают ранее полученные данные по возрастной динамике митохондриальной сети в скелетной мышце голого землекопа [doi: 10.18632/aging.203720], а полученные нами данные подтверждают старческие изменения в митохондриях скелетных мышц при тяжелой физической нагрузке на фоне гипероксии, не выявляемые на гистологии (рис 2В). Для изучения степени карбонилирования применяли метод, описанный в работе Бруно и коллег (https://doi.org/10.1016/j.dib.2018.06.088 2352-3409) при помощи набора для обнаружения окисления белка OxyBlot™,Merk Millipore, Darmstadt, Germany. Данные для белков метаболического компартмента периферических киназ митохондрий сердца, показанных нами как ключевой компонент системы мягкой деполяризации и защиты от окислительного стресса (doi: 10.1073/pnas.1916414117) представлены на рис 3 (репрезентативные блоты). В то время как степень карбонилирования гексокиназы 2 и креатинкиназы в митохондриях скелетных мышц достоверно выше для кахексичных животных (р=0.012, p=0.035, соответственно), для VDAC1 и ANT1 достоверных различий не обнаружено, что говорит о затруднении модификаций в липидной фазе и отсутствии сайтов карбонилирования на поверхности, экспонированной в водную фазу. Полученные ранее данные об окислительном повреждении кардиолипина свидетельствуют, что в основе нарушения прочности протеолипидных комплексов в контактных сайтах лежит повреждение липидов, а не интегральных мембранных белков.

Публикации