Исследование нейрон-глиальных перестроений в головном мозге в норме и при патологии с помощью метода 3D-корреляционной микроскопии высокого разрешения

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00168

НазваниеИсследование нейрон-глиальных перестроений в головном мозге в норме и при патологии с помощью метода 3D-корреляционной микроскопии высокого разрешения

Руководитель Олейников Владимир Александрович, Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика

Ключевые слова нейрон, астроцит, нейрон-глиальные взаимодействия, имиджинг, болезнь Альцгеймера, электронная микроскопия, сканирующая-зондовая микроскопия, флуоресцентная микроскопия, оптико-зондовая нанотомография, корреляционная 3D-микроскопия

Код ГРНТИ34.05.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одна из наиболее актуальных проблем современных биомедицинских исследований – поиск способов предотвращения нейродегенеративных заболеваний на ранних стадиях развития. Предполагается, что развитие патологий мозга начинается с изменений в астроцитах.Астроциты обеспечивают метаболическую поддержку и защиту нейрональных клеткок, нейрон-астроцитарные взаимодействия лежат в основе работы головного мозга. Отростки астроцитов находятся в тесном контакте с синапсами, образуя астроцитарное покрытие, обеспечивающее поддержание, обслуживание, изоляцию синапса. При нормальных физиологических процессах (развитии и старении мозга), а также при патологических процессах (эпилепсии, болезни Альцгеймера) наблюдаются значительные изменения в нейрон-астроцитарных взаимодействиях. В частности, данные изменения регулируются отростками астроцитов. Однако клеточные и молекулярные механизмы изменений в астроцитарных отростках малоизучены. Отчасти это связано с тем, что переферические астроцитарные отростки (средняя толщина около 100 нм), формирующие основу синаптического покрытия, лежат за пределами разрешающей способности оптического микроскопа и не могут быть визуализированы с помощью оптической конфокальной или двухфотонной микроскопии (ОМ). Методы микроскопии высокого разрешения (электронная и сканирующая-зондовая микроскопия, СЗМ) позволяют исследовать ультраструктуру клеточных компонентов с разрешением до единиц нанометров. Однако, недостаток большинства подобных методик – отсутствие возможности проведения наномасштабного химического анализа (например, методом оптической спектроскопии), совмещенного с визуализацией ультраструктуры, и отсутствие возможности полноценного 3D-анализа образцов. Для решения указанной проблемы в данном проекте мы предлагаем использование корреляционной наномасштабной 3D-микроспектроскопии, основанной на объединении СЗМ, конфокальной и флуоресцентной ОМ и техники ультрамикротомии. Данная методика (Оптико-Зондовая Нанотомография, ОЗНТ) разработана коллективом заявителей проекта и реализована на базе уникальной научной установки (УНУ «Система Зондово-Оптической 3D Корреляционной Микроскопии», http://ckp-rf.ru/usu/486825/). Методика будет применена для исследования астроцитарных структур в норме и на различных стадиях развития болезни Альцгеймера (мышиная модель 5xFad) и использована параллельно с просвечивающей электронной микроскопией с целью получения коррелятивных изображений на одних и тех же участках образца. К полученным данным будут применены подходы анализа и алгоритмы обработки изображений для получения 3D реконструкций. Эта технология позволит получить информацию как о трехмерной наноструктуре отростков астроцитов, так и об экспрессии в них определенных белков (рецепторов, каналов, транспортеров), что может быть использовано для выявления механизмов развития и новых критериев диагностики нейродегенеративных заболеваний. Результаты данных исследований послужат фундаментальной основой для создания передовых методик предотвращения нейродегенеративных заболеваний. Важно также отметить, что на текущий момент не существует опубликованных работ по 3D наномасштабному исследованию корреляции ультраструктуры биологических объектов и их оптических свойств (спектральный анализ, флуоресцентное мечение). Суммируя все вышеперечисленное, можно утверждать, что планируемые в рамках данного проекта результаты комплекса целевых исследований, несомненно, обладают новизной и значительной научной и практической ценностью.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Яковлев Д., Колесова Е., Сизова С., Аннас К., Третьяк М., Лощенов В., Орлова А., Олейников В. New Conjugates Based on AIS/ZnS Quantum Dots and Aluminum Phthalocyanine Photosensitizer: Synthesis, Properties and Some Perspectives Nanomaterials (Basel, Switzerland), 2022, 12(21), 3874 (год публикации - 2022)
10.3390/nano12213874

2. О. И. Агапова, А. Е. Ефимов, К. Е. Мочалов, Д. О. Соловьева, А. М. Гилева, Е. А. Марквичева, Д. В. Яковлев, А. В. Люндуп, В. А. Олейников, И. И. Агапов, С. В. Готье Исследование внутриклеточного распределения доксорубицина в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 методом корреляционной сканирующей флуоресцентно-зондовой нанотомографии Доклады академии наук, Доклады академии наук (DANBio2260019Agapova (год публикации - 2023)

3. Мочалов К.Е., Сутягина О.И., Алтунина А.В., Соловьева Д.О., Ефимов А.Е., Жучков В.А., Чумаков С.П., Олейников В.А. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ФЛУОРЕСЦЕНТНО-КОНСТРАСТИРУЮЩЕГО ИММУНООКРАШИВАНИЯ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ 3D АСТРОЦИТАРНОЙ УЛЬТРАМОРФОЛОГИИ Биоорганическая химия (год публикации - 2023)

4. Мочалов К.Е., Коржов Д.С., Алтунина А.В., Агапова О.И., Олейников В.А. Ультраструктурная 3D-микроскопия для биомедицины. Принципы, применения, перспективы ActaNaturae (год публикации - 2024)

5. ОБРАЗЦОВА Е.А., СОРОКИНА Е.В., БИРЮКОВ С.И., ЗАРУБИНА А.П., КЛИНОВ Д.В. ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ НАНОМАТЕРИАЛОВ ИЗ УГЛЕРОДА И НИТРИДА БОРА Новые наноматериалы и их электромагнитные свойства. Труды международного Седьмого Российско- Белорусского семинара. Улан-Удэ, 11-15 сентября 2023 г. / под ред. В.И..Сусляева. - Томск: Изд-во НТЛ, Новые наноматериалы и их электромагнитные свойства. Труды международного Седьмого Российско- Белорусского семинара. Улан-Удэ, под ред. В.И..Сусляева. - Томск: Изд-во НТЛ,2023.- 120с. (год публикации - 2023)

6. Агапова О.И., Ефимов А.Е., Образцова Е.А., Мочалов К.Е., Соловьева Д.О., Олейников В.А., Агапов И.И., Готье С.В. Идентификация ультраструктурных деталей систем отростков астроцитов в нервной ткани головного мозга с использованием коррелятивной сканирующей зондовой и просвечивающей электронной микроскопии ДОКЛАДЫ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК. НАУКИ О ЖИЗНИ, том 515, с. 76–80 (год публикации - 2024)
10.31857/S2686738924020146

7. Мочалов К.Е., Агапова О.И., Агапов И.И., Коржов Д.С., Соловьева Д.О., Сизова С.В., Шестопалова М.С., Олейников В.А., Ефимов А.Е. Флуоресцентная оптическая нанотомография: объединение техник флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения и ультрамикротомии Наноиндустрия, Т. 17. № 7–8. С. 428–433. (год публикации - 2024)
10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433

8. Мочалов К. Е., Коржов Д. С., Алтунина А. В., Агапова О. И., В. А. Олейников Ультраструктурная 3D-микроскопия для биомедицины. Принципы, применение, перспективы. ACTA NATURAE, ТОМ 16 № 1 (60) (год публикации - 2024)
10.32607/actanaturae.27323

9. Васкан И.С., Приходько А.Т., Петухов М.В., Штыкова Е.В., Бовин Н.В., Тузиков А.Б., Олейников В.А., Залыгин А.В. Assessment of core-shell nanoparticles surface structure heterogeneity by SAXS contrast variation and ab initio modeling Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, том 224, стр. 113183 (год публикации - 2023)
10.1016/j.colsurfb.2023.113183

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
При болезни Альцгеймера (БА) снижается уровень глутаматного транспортера GLT-1, что приводит к накоплению глутамата, эксайтотоксичности, повреждению нейронов и когнитивным нарушениям. Хроническое воспаление, активация микроглии, дистрофия астроцитов и накопление β-амилоида нарушают функцию GLT-1. Гиперэкспрессия коннексина 43 (Cx43) усиливает нейровоспаление и дисфункцию астроцитов. Методы ОЗНТ позволяют изучать изменения астроглии на уровне тонких отростков. Нами получены трехмерные реконструкции на основе флуоресцентного иммуноцитохимического картирования распределения GLT-1 и гэп-контактов (коннексин Cx43) на ультраструктурном уровне методом ОЗНТ для образцов гиппокампа, полученых от здоровой особи и особи с БА. Использованы мыши трансгенной линии 5xFAD, как и на предыдущих этапах проекта. для коннексина у особей с БА – доля занимаемого объема Vf составила (1.31±0.25)*10^-3, отношение площади к объему Sv = 6.71±1.2 1/мкм, фрактальная размерность Df = 2.04±0.02 здоровый: доля занимаемого объема Vf =(0.78±0.156)*10^-3, Sv = 7.46±1.1 1/мкм фрактальная размерность Df = 2.03±0.02. На основании кластерного анализа 14 образцов установлено, что для распределения коннексина Cx43 статистически значимо увеличение доли объема Vf на 3D ОЗНТ-реконструкциях, тогда как изменения Sv и Df несущественны. Распределение глутаматных транспортеров более однородно у здоровых особей (Vf = 8.8±2.2%), тогда как у особей с БА оно снижается до 4.1±0.9%. Однако при высокой однородности GLT-1 теряет специфичность для тонких отростков, оставаясь индикатором патологии. Рекомендуется использовать параметр Vf для коннексина в сочетании с параметрами GFAP (Sv и Df), подтвержденными ранее. На поздних стадиях развития БА происходит накопление бета амилоидных бляшек, нейродегенерация, нейровоспаление, при этом происходит накопление GFAP в астроцитах, и они становятся реактивными. Распределение GFAP практически полностью совпадает с телом астроцита до тонких отростков, что позволяет провести его первичное трассирование в образце еще до начала проведения срезов. Были выполнены трехмерные ОЗНТ-реконструкции на основе коррелятивного флуоресцентного иммуноцитохимического картирования распределения коннексина Cx43 и GFAP в астроцитарных отростках здоровой особи и с БА. Разрешение выполненных реконструкций по глубине (оси Z) составляло 100 нм. Был выполнен анализ полученных реконструкций по параметрам, выбранным в качестве статистически значимых по результатам предыдущих исследований: Sv и Df для объемного распределения GFAP, Vf и Sv для объемного распределения коннексина Cx43. У особей с БА: для распределения GFAP среднее отношение площади к объему составило Sv = 1.36 ± 0.2 1/мкм, а фрактальная размерность Df = 2.21±0.07 для распределения коннексина Cx43 – доля занимаемого объема Vf составила (1.42±0.26)*10^-3, отношение площади к объему Sv = 6.45 ± 1.3 1/мкм, У здоровых особей: для распределения GFAP, отношение площади к объему составило Sv = 2.04 ± 0.26 1/мкм, а фрактальная размерность Df = 2.43±0.02. для распределения коннексина Cx43 – доля занимаемого объема составила Vf =(0.86±0.14)*10^-3, отношение площади к объему Sv = 6.07 ± 1.3 1/мкм., также можно отметить что в случае здоровых особей распределение коннексина Cx43 более коррелирует с распределением GFAP. Однако, необходимо учитывать, что ограничения оптической микроскопии в разрешении XY снижают точность определения морфологии тонких отростков астроцитов. Мы выполнили коррелятивные 3D ОЗНТ-реконструкции данных СЗМ и флуоресцентных маркеров, полученных конфокальной микроскопией у здоровой особи и особи с БА (объем 15.0х15.0х1.0 мкм). Реконструкция позволила восстановить 3D-структуру отростков с разрешением XY СЗМ (15 нм/пиксель). Также был проведен анализ параметров отношения площади поверхности к объему и фрактальной размерности для полученных реконструкций, показавший, что для реконструкций астроцитарных отростков здоровой особи: - отношение площади к объему составило Sv = 2.32 ± 0.2 1/мкм, а фрактальная размерность Df = 2.56±0.04. для особей с БА: - среднее отношение площади к объему составило Sv = 1.52 ± 0.2 1/мкм, а фрактальная размерность Df = 2.27±0.07. Заметим, что оба вычисляемых параметра возрастают, по сравнению с величинами, полученными при анализе коррелятивных флуоресцентных распределений. Это соответствует росту детализации изображений сложной структуры поверхностей отростков. При этом растет и относительное отличие параметров для случаев здоровой особи и особи с БА, что говорит об эффективности коррелятивных ОЗНТ-реконструкций с использованием зондовых и конфокальных данных для оценки состояния астроцитарных отростков согласно разработанным критериям, по сравнению с данными только флуоресцентной нанотомографии. В задачи 3 года входила выработка ряда рекомендаций по дальнейшему повышению эффективности анализа данных, получаемых методом ОЗНТ. В частности: (1) Рекомендации по усовершенствованию программных методов сегментации 3D-изображений, основанные на использовании математической модели построения модельных флуоресцентных изображений от нескольких СЗМ-изображений в районе центральной линии экспериментально полученного флуоресцентного изображения с последующим сравнением и выбором оптимального СЗМ-изображения. (2) Рекомендации по выбору оптимальной программной среды для обработки всего массива данных, получаемых методом ОЗНТ, с возможностью применения методов Python и MATLAB внутри данной среды. Наиболее оптимальной при такой постановке задаче оказалась программная среда «3D Slicer». (3) Рекомендации по внедрению машинного и/или глубокого обучения. В частности, подготовка (сбор, аннотация и предварительная обработка) данных, выбор подходящих алгоритмов (машинное/глубокое обучение), разработка модели (определение архитектуры и настройка гиперпараметров), обучение модели, оценка качества и валидация, и интеграция с последующей оптимизацией. В рамках заключительного этапа проекта была предложена концепция использования конъюгатов GFAP-специфичных наноантител и флуоресцентных нанокристаллов для визуализации астроцитарных структур методом ОЗНТ и разработаны методики синтеза необходимых лигандов и их ковалентной пришивки к поверхности нанокристаллов. Также был разработан метод специфического флуоресцентного окрашивания астроцитов с использованием GFAP-специфичных нанотел являющийся первым и необходимым шагом для реализации предложенной концепции.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Предложенные в проекте возможности методики оптическо-зондовой нанотомографии открывают возможность качественного нового уровня анализа клеток и тканей человека, животных, растений. Также с возможностью применения в области материаловедения. Данная технология позволит анализировать объекты вплоть до молекулярного уровня, включая возможности спектрального химического картирования.