Микробная темная материя: идентификация и характеристика новых некультивируемых линий бактерий и архей

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00178

НазваниеМикробная темная материя: идентификация и характеристика новых некультивируемых линий бактерий и архей

Руководитель Равин Николай Викторович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова некультивируемые микроорганизмы, геном, экология микроорганизмов, микробное сообщество, метагеномика

Код ГРНТИ34.27.21

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Микроорганизмы представляют собой наиболее разнообразную и многочисленную форму жизни, в значительной мере определяющую основные биогеохимические процессы на Земле. Тем не менее, наши знания о разнообразии микроорганизмов и осуществляемых ими процессах весьма ограничены, в первую очередь, из-за того, что, как правило, не более 1% микроорганизмов из природных экосистем удается культивировать в стандартных лабораторных условиях, и, следовательно, идентифицировать и охарактеризовать традиционными микробиологическими и биохимическими методами. О существовании остальных 99% «некультивируемых» стало известно лишь с появлением молекулярных методов анализа, в результате идентификации соответствующих «новым» микроорганизмам последовательностей генов 16S рибосомной РНК непосредственно в природных экосистемах, без культивирования. Такие «новые» микроорганизмы обнаруживают не только в известных группах, они образуют и отдельные филогенетические линии высокого уровня. Так, благодаря применению молекулярно-генетических методов в микробиологии за последние 20 лет число известных таксонов высшего уровня (филумов) бактерий и архей увеличилось в несколько раз. В настоящее время известно уже около 150 бактерий и архей, более половины которых не имеет культивируемых представителей. Общее же число филумов прокариот оценивается примерно в тысячу. Однако, хотя микроорганизмы «некультивируемых» групп широко распространены в различных экосистемах и могут играть ключевые роли в важных биогеохимических процессах на Земле, о них практически ничего (метаболизм, экологическая роль и тп) не известно. Чтобы подчеркнуть масштабы и значение некультивируемых микроорганизмов, недавно для них был предложен термин «микробная темная материя». Целью проекта является идентификация и характеристика новых некультивируемых линий микроорганизмов. Основным инструментом изучения некультивируемых микроорганизмов является геномный анализ, позволяющий описать свойства нового микроорганизма на основе его генома, что затем создает основу для культивирования и экспериментальной характеристики. Метагеномика, анализ «коллективного» генома микробного сообщества и выделение из него методами биоинформатики геномов отдельных организмов, позволяют на геномном уровне описать «некультивируемые» линии микроорганизмов и предсказать их функциональную роль в экосистеме, и с другой стороны, дают возможность описания генетического разнообразия, метаболизма микробного сообщества и осуществляемых им биогеохимических процессах. Одним из наиболее интересных объектов современной микробиологии являются микроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях окружающей среды. Культивирование экстремофилов в лабораторных условиях является сложной задачей, в связи с чем доля «некультивируемыми» групп среди них особенно велика. Вследствие этого значительная часть, если не большинство, некультивируемых линий бактерий и архей были обнаружены именно в экстремальных экосистемах. Конкретной задачей проекта является идентификация и характеристика на геномном уровне новых филогенетических линий «некультивируемых» микроорганизмов в результате метагеномного анализа микробных сообществ экстремальных экосистем. В рамках проекта планируется исследовать два типа таких экосистем, - подземную биосферу и термальные экосистемы, ассоциированные с районами подземного горения угольных пластов. Согласно последним оценкам подземная биосфера содержит от 12 до 20% всей биомассы микроорганизмов на Земле, при этом она остается одной их наименее изученных экологических ниш. Проведенные в последние годы с использованием методов метагеномики исследования выявили в подземных экосистемах новые линии некультивируемых микроорганизмов, играющих важную роль в циклах углерода, азота и серы. Именно геномные исследования подземной биосферы в последние годы существенно расширили наши знания о разнообразии и эволюции микроорганизмов в целом и стали одним из основных источников геномных данных о новых некультивируемых филогенетических линиях высокого уровня, включая несколько новых филумов. В рамках проекта будет проведено масштабное метагеномное исследование разных типов подземных экосистем. Первым объектом будут являться глубинные подземные воды, залегающие на глубинах 1-3 км и имеющие температуру до 90С. Предполагается, что эти водные резервуары содержат эндогенные микробные сообщества, адаптированные к экстремальным условиям и изолированные от поверхностной биосферы на протяжении миллионов лет. Вторым объектом будут минерализованные подземные воды неглубокого залегания (до 1 км), выходящие на поверхность в виде артезианских скважин. Химические характеристики этих вод весьма разнообразны, что отражается и в разнообразии состава микробных сообществ. Третий тип объектов - встречающиеся в тектонически активных районах грязевые вулканы, из которых на поверхность поступают грязевые массы и газы, поднимающиеся по сети трещин, которая часто простирается на несколько километров в глубину. Грязевые вулканы обеспечивают доступ к глубинной подземной биосфере, поскольку относительно быстрый перенос жидкости по сети трещин доставляет на поверхность эндогенные подземные микроорганизмы. Планируется исследовать грязевые вулканы Керченско-Таманского региона. Еще один тип экстремальных экосистем, которые планируется исследовать в рамках проекта - микробные сообщества грунтов в районах подземного горения угольных пластов. Горение угля в условиях недостатка кислорода и в присутствии воды сопровождается выделением угольных газов, в основном водорода, СО и СО2. В районах выхода горячих газов на поверхность могут образовываться локальные экстремальные экосистемы. Содержащиеся в угольных газах водород и СО могут использоваться микроорганизмами в качестве субстратов, что определяет возможность развития термофильных микробных сообществ с преимущественно хемолитоавтотрофным метаболизмом. В отличие от других термальных экосистем, эти объекты имеют небольшой возраст и являются удобной моделью для изучения процессов колонизации термофильными микроорганизмами новых экологических ниш. В ходе выполнения проекта планируется провести определить физико-химические характеристики исследуемых объектов, проанализировать составы микробных сообществ с помощью высокопроизводительного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, для образцов, содержащих значительную долю новых некультивируемых линий прокариот, провести секвенирование метагенома с использованием технологий Illumina и Oxford Nanopore. На основе метагеномных данных будут получены последовательности геномов микроорганизмов – членов сообществ (metagenome-assembled genomes), в том числе представителей некультивируемых линий. В результате анализа геномов будет определено положение этих линий в геномной таксономической системе, охарактеризованы особенности их эволюции, проведена реконструкция путей метаболизма, анализ функциональной роли и взаимосвязей между микроорганизмами в сообществе. Будет проведена экспериментальная проверка предсказанных на основе геномного анализа свойств новых микроорганизмов. Геномная информация о путях метаболизма некультивируемых микроорганизмов будет использована для выбора стратегии их культивирования (genome-based cultivation). В результате выполнения проекта будут идентифицированы и описаны на геномном уровне новые «некультивируемые» линии бактерий и архей, что расширит наши знания о разнообразии и эволюции микроорганизмов, их роли в биосфере, будут получены приоритетные данные о составе и функциональной роли микробных сообществ малоисследованных экстремальных экосистем.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Лукина А.П., Кадников В.В., Русанов И.И., Авакян М.Р., Белецкий А.В., Марданов А.В., Пименов Н.В., Равин Н.В., Карначук О.В. Анаэробные Thermodesulfovibrio и аэробные Meiothermus сосуществуют в глубинной термальной воде Микробиология (год публикации - 2023)

2. Кадников В.В., Марданов А.В., Белецкий А.В., Карначук ОВ., Равин Н.В. Prokaryotic life associated with coal-fire gas vents revealed by metagenomics Biology, 12, 723 (год публикации - 2023)
10.3390/biology12050723

3. Карначук ОВ, Русанов И, Панова Я, Кадников ВВ, Авакьян МР, Иккерт ОП, Лукина АП, Белецкий АВ, Марданов АВ, Князев ИВ, Волочаев МН, Пименов НВ, Равин НВ The low-temperature germinating spores of the thermophilic Desulfofundulus contribute to an extremely high sulfate reduction in burning coal seams Frontiers in Microbiology, 14, 1204102 (год публикации - 2023)
10.3389/fmicb.2023.1204102

4. Карначук О.В., Панова Я., Русанов И., Схетинина Л., Лепокурова О., Домрочева Е.В., Кадников В.В., Авакян М., Лукина А.П., Глухова Л.Б., Пименов Н.В., Равин Н.В. Coexistence of psychrophilic, mesophilic, and thermophilic sulfate-reducing bacteria in a deep subsurface aquifer associated with coal-bed methane production Microbial Ecology, 86,1934–1946 (год публикации - 2023)
10.1007/s00248-023-02196-9

5. Русанов И. И., Кадников В.В., Лукина А.П., Данилова Э.В., Соколянская Л.О., Равин Н.В., Карначук О.В. Low-Abundance Sulfidogenic Bacteria Carry out Intensive Sulfate Reduction in Terrestrial Hydrotherms of the Barguzin Valley Microbiology, Vol. 92, Suppl. 1, pp. S29–S32 (год публикации - 2023)
10.1134/S0026261723603603

6. Карначук О.В., Лукина А.П., Авакян М.Р., Кадников В.В., Бегматов Ш., Белецкий А.В., Власова К.Г., Новиков А.А., Щербакова В.А., Марданов А.В., Равин Н.В. Novel thermophilic genera Geochorda gen. nov. and Carboxydochorda gen. nov. from the deep terrestrial subsurface reveal the ecophysiological diversity in the class Limnochordia Frontiers in Microbiology, 15:1441865 (год публикации - 2024)
10.3389/fmicb.2024.1441865

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Микроорганизмы представляют собой наиболее разнообразную и многочисленную форму жизни, в значительной мере определяющую основные биогеохимические процессы на Земле. Тем не менее, наши знания о разнообразии микроорганизмов и осуществляемых ими процессах весьма ограничены, в первую очередь, из-за того, что, как правило, не более 1% микроорганизмов из природных экосистем удается культивировать в стандартных лабораторных условиях, и, следовательно, идентифицировать и охарактеризовать традиционными микробиологическими и биохимическими методами. Хотя микроорганизмы «некультивируемых» групп широко распространены в различных экосистемах и могут играть ключевые роли в важных биогеохимических процессах на Земле, о них практически ничего (метаболизм, экологическая роль и тп) не известно. Чтобы подчеркнуть масштабы и значение некультивируемых микроорганизмов, недавно для них был предложен термин «микробная темная материя». Целью проекта является идентификация и характеристика на геномном уровне новых филогенетических линий «некультивируемых» микроорганизмов в результате метагеномного анализа микробных сообществ экстремальных экосистем. В течение 3 года работы проведено секвенирование метагеномов образцов, отобранных по результатам анализа состава сообществ по генам 16S рРНК и содержащих некультивируемые линии микроорганизмов, - донных осадков термального источника в Бурятии и флюида из грязевого вулкана Керченского полуострова, отобранного с глубины 20 см. Из просеквенированных метагеномов собраны последовательностей геномов геномов отдельных организмов-членов сообщества (MAG), определена их таксономическая принадлежность, проведена аннотация геномных последовательностей.. Из метагенома осадков термального источника в Бурятии собрано 85 MAG высокого качества (полнота более 90%, загрязнение менее 5%), пригодных для реконструкции путей метаболизма и описания новых кандидатных таксонов. Получены геномы некультивируемых кандидатных филумов архей Aenigmatarchaeota и Hadarchaeota, и бактерий CLD3, CSP1-3, Edwardsbacteria, Goldbacteria, Lithacetigenota, Poribacteria, QNDG01, RBG-13-61-14, и SLNR01. Из метагенома флюида грязевого вулкана было собрано 7 MAG высокого качества, в том числе геном археи некультивируемой линии ANME-1. Анализ геномов представителей некультивируемых филумов выявил разнообразие возможностей их метаболизма. Бактерия филума CLD3 является органотрофом, способным сбраживать низкомолекулярные органические вещества или окислять их в микроаэрофильных условиях. Представитель филума CSP1-3 является анаэробом, способным использовать низкомолекулярные органические вещества в процессе брожения или нитрит редукции. Представитель филума QNDG01 является анаэробом, способным использовать сложные полисахариды, осуществляя брожение. Бактерия филума RBG-13-61-14 является органотрофным анаэробом и способна осуществлять диссимиляционную сульфат редукцию. Археи кандидатных филумов EX4484-52 и B1Sed10-29 имеют редуцированные геномы и ограниченные возможности ферментативного метаболизма, с потерей ключевых биосинтетических путей. Вероятно, эти археи являются симбионтами или паразитами других микроорганизмов. Анализ генома археи линии ANME-1с (Methanospirareceae) из грязевого вулкана выявил наличие ферментов для анаэробного окисления метана и путь Вуда-Льюнгдаля. Вероятными партнёрами ANME архей являются сульфат-редукторы филума Desulfobacterota, обнаруженные нами в грязевом вулкане и охарактеризованные на геномном уровне. Определены и проанализированы геномы двух новых культивируемых штаммов - представителей класса Limnochordia филума Firmicutes. Реконструкция путей метаболизма выявила пути анаэробного и аэробного дыхания, с использованием фумарата и кислорода, соответственно. Штаммы могут расти ферментативно и деградировать различные полимеры, включая крахмал, мальтодекстрин, ксилан и хитин. Один из геномов кодирует путь автотрофной фиксации СО2 в цикле Кальвина, и ферменты, обеспечивающие использование CO, H2 и формиата в качестве доноров электронов для аэробного дыхания, что указывает на метаболическую гибкость этой бактерии в бедной питательными веществами глубинной подземной биосфере и возможность аэробного метаболизма в этих экосистемах. В результате выполнения проекта идентифицированы и описаны на геномном уровне новые «некультивируемые» линии бактерий и архей, что расширяет наши знания о разнообразии и эволюции микроорганизмов, их роли в биосфере, получены приоритетные данные о составе и функциональной роли микробных сообществ малоисследованных экстремальных экосистем.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта имеют в первую очередь фундаментальное значение, расширяя наши знания о разнообразии, физиологии и экологической роли микроорганизмов, тем самым создавая научный задел для последующих ориентированных и прикладных исследований. Практическая значимость исследования некультивируемых линий микроорганизмов и их сообществ связана с тем, что они могут служить источником новых функциональных решений для биотехнологии. Некультивируемые микроорганизмы также могут быть использованы для идентификации представляющих практический интерес новых ферментов (например, новых редакторов генома, гидролаз и тп) и путей метаболизма. Определение путей метаболизма некультивируемых микроорганизмов создает основу и для выделения их в чистые культуры, что было продемонстрировано для двух штаммов фирмикут класса Limnochordia. Один из штаммов может расти автотрофно на компонентах синтез-газа (водород и СО) и может быть использован для разработки технологий получения микробного белка. Другими перспективными объектами являются новые охарактеризованные линии сульфат-редукторов, которые могут быть использованы для осаждения металлов из отходов горнодобывающей промышленности.