Программируемые ДНК-зависимые РНК-нуклеазы - защитная система бактерий и инструмент для регуляции экспрессии генов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00182

НазваниеПрограммируемые ДНК-зависимые РНК-нуклеазы - защитная система бактерий и инструмент для регуляции экспрессии генов

Руководитель Кульбачинский Андрей Владимирович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова программируемые нуклеазы, белки-Аргонавты, бактериальные защитные системы, гидовые ДНК, процессинг и модификация РНК, сайленсинг генов

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Программируемые нуклеазы являются главными компонентами защитных и регуляторных систем клетки, узнающих целевые нуклеиновые кислоты с помощью комплементарных гидовых молекул. Программируемые нуклеазы стали важнейшим инструментом генетической инженерии, биотехнологии и медицины. Поиск и характеристика новых классов таких нуклеаз имеет принципиальное значение для понимания основных механизмов генетической регуляции и защиты клеток от чужеродных генетических элементов, а также для развития новых подходов к редактированию геномов и направленной регуляции экспрессии генов. Два основных типа программируемых нуклеаз – системы CRISPR-Cas и белки-Аргонавты. CRISPR-Cas являются системами адаптивного иммунитета прокариот и используют гидовые РНК, закодированные в CRISPR-кассетах, для узнавания и разрушения чужеродной ДНК или РНК при ее попадании в клетку. Белки-Аргонавты эукариот играют главную роль в процессах РНК-интерференции и используют короткие РНК различного происхождения для узнавания мРНК-мишеней. Белки-Аргонавты также закодированы в геномах многих бактерий и архей, причем они гораздо более разнообразны, чем Аргонавты эукариот, и намного меньше изучены. В отличие от своих эукариотических гомологов, большинство известных Аргонавтов прокариот используют короткие гидовые ДНК для узнавания и расщепления ДНК-мишеней. Нами показано, что такие Аргонавты способны защищать клетки бактерий от плазмид и бактериофагов. Недавно нами открыт новый уникальный класс бактериальных белков-Аргонавтов, которые используют ДНК-гиды для узнавания РНК-мишеней (ДНК-РНК Аргонавты). Подобная специфичность не характерна ни для каких других типов нуклеаз, что позволяет предполагать участие ДНК-РНК Аргонавтов в неизвестных путях защиты клеток от чужеродных элементов, а также в регуляции транскрипции. Белки с такой специфичностью могут также служить перспективным инструментом для направленного подавления экспрессии генов как у прокариот, так и в клетках эукариот. Данный проект направлен на детальное исследование свойств ДНК-РНК Аргонавтов и разработку подходов для их практического использования в системах in vitro и in vivo. Конкретные задачи проекта: 1. Биоинформатический анализ ДНК-РНК Аргонавтов в геномах и метагеномах прокариот. Характеристика ключевых функциональных элементов найденных белков. Клонирование, экспрессия и очистка выбранных белков-кандидатов из разных подгрупп ДНК-РНК Аргонавтов. 2. Характеристика биохимической активности и специфичности новых представителей ДНК-РНК Аргонавтов. Изучение механизмов связывания гидовых ДНК и таргетных РНК белками данного класса, анализ структурных особенностей Аргонавтов, участвующих в связывании гидов и мишеней. Разработка подходов к использованию ДНК-РНК Аргонавтов для детекции вторичной структуры РНК и выявления сайт-специфических модификаций в РНК. 3. Исследование биогенеза коротких гидовых ДНК, связываемых ДНК-РНК Аргонавтами, в клетках бактерий. Изучение роли каталитической активности Аргонавтов, а также клеточных нуклеаз, в этом процессе. Поиск факторов, определяющих предпочтительную генерацию гидовых молекул из определенных участков генома. 4. Изучение влияния ДНК-РНК Аргонавтов на выживаемость и адаптацию клеток бактерий в нормальных и стрессовых условиях. Анализ способности ДНК-РНК Аргонавтов подавлять экспрессию генов-мишеней в клетках бактерий и разработка подходов к направленному сайленсингу генов у бактерий с использованием Аргонавтов данного класса. 5. Анализ защитной функции ДНК-РНК Аргонавтов и изучение их влияния на трансформацию бактерий, поддержание плазмидной ДНК и бактериофаговую инфекцию. 6. Изучение белков-партнеров ДНК-РНК Аргонавтов. Клонирование и выделение ассоциированных с ними дополнительных нуклеаз и анализ их активности и взаимодействия с Аргонавтами. 7. Разработка способов экспрессии и доставки ДНК-РНК Аргонавтов в клетки эукариот, исследование специфичности их взаимодействий с эндогенными и экзогенными нуклеиновыми кислотами. Разработка методов сайленсинга, мечения и модификации целевых мРНК-транскриптов в клетках эукариот с использованием ДНК-РНК Аргонавтов. Выполнение проекта должно значительно расширить наши представления о работе защитных систем прокариот и может привести к разработке новых инструментов для детекции и модификации РНК in vitro, а также для направленной генетической регуляции и сайленсинга генов в клетках бактерий и эукариот.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Лисицкая Л., Шин Й., Агапов А., Олина А., Кропочева Е., Рязанский С., Аравин А.А., Есюнина Д., Мураками К.С., Кульбачинский А. Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity Nature Communications, том 13, номер 1, с. 4624 (год публикации - 2022)
10.1038/s41467-022-32079-5

2. Простова М., Каневская А., Пантелеев В., Лисицкая Л., Перфилова К.В., Случанко Н.Н., Есюнина Д., Кульбачинский А. DNA-targeting short Argonautes complex with effector proteins for collateral nuclease activity and bacterial population immunity. Nature Microbiology, Nature Microbiology. 9(5):1368-1381. (год публикации - 2024)
10.1038/s41564-024-01654-5

3. Агапов А., Лисицкая Л., Кусакина К.. Кропочева Е., Есюнина Д., Кульбачинский А. Unusual guide-binding pockets in RNA-targeting pAgo nucleases. Journal of Molecular Biology, J. Mol. Biol. 436(20):168745. (год публикации - 2024)
10.1016/j.jmb.2024.168745

4. Агапов А., Пантелеев В., Кропочева Е., Каневская А., Есюнина Д., Кульбачинский А. Prokaryotic Argonaute nuclease cooperates with co-encoded RNase to acquire guide RNAs and target invader DNA. Nucleic Acids Research, Nucleic Acids Res. 52(10):5895-5911 (год публикации - 2024)
10.1093/nar/gkae345

5. Простова М.А., Каневская А.А., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Тест-система для детекции целевой ДНК или РНК с использованием короткого белка-аргонавта в комплексе с нуклеазой и флуоресцентного репортера Федеральная служба по интеллектуальной собственности, Патент на изобретение № 2821993. Заявка № 2023115951. Приоритет изобретения 19 июня 2023 г. Дата государственной регистрации в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 28 июня 2024 г. (год публикации - 2024)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект посвящен изучению программируемых нуклеаз из семейства прокариотических белков-Аргонавтов. В задачи проекта входило исследование новых групп бактериальных и архейных Аргонавтов, которые узнают специфические мишени и участвуют в их деградации, либо напрямую за счет собственной нуклеазной активности, либо опосредованно, активируя ассоциированные с ними эффекторные нуклеазы. Значительная часть работы была посвящена изучению открытых нами Аргонавтов, которые используют короткие ДНК-гиды для узнавания и расщепления РНК-мишеней (ДНК>РНК Аргонавты). За отчетный период было завершено исследование активности этих белков, а также ассоциированных с ними дополнительных нуклеаз в системе in vitro; исследована активность ДНК>РНК Аргонавтов в клетках бактерий и изучена их роль в защите клеток от чужеродных генетических элементов - плазмид и бактериофагов; изучены возможности их использования для подавления экспрессии целевых генов у бактерий и эукариот. Кроме того, продолжены исследования коротких каталитически неактивных Аргонавтов, которые при узнавании специфических мишеней способны активировать кодируемые совместно с ними нуклеазы. Установлен детальный механизм активации таких аргонавтов и ассоциированных эффекторных нуклеаз в системе in vitro и изучена их роль в противовирусной защите клеток. Основные полученные результаты за третий период работы перечислены ниже. 1. Исследована активность Cas4-подобной нуклеазы, которая кодируется совместно с ДНК>РНК Аргонавтами. Показано, что эта нуклеаза обладает ДНКазной активностью, образует прочный комплекс с белком-Аргонавтом и влияет на его активность в системе in vitro. Предположено, что данная нуклеаза может принимать участие в процессинге гидовых ДНК, используемых белком-Аргонавтом. В то же время, нуклеаза не влияет на спектр гидовых ДНК, связанных с Аргонавтом в клетках бактерий в исследованных условиях. Вероятно, для активации комплекса Аргонавта с нуклеазой in vivo необходимо участие дополнительнных факторов. 2. Показано, что ДНК>РНК Аргонавты способны защищать клетки бактерий от некоторых плазмид и бактериофагов. Роль ассоциированной с Аргонавтом нуклеазы в этой защите различна в зависимости от бактериофага; для защиты от некоторых фагов необходимо совместное действие Аргонавта и нуклеазы. Таким образом, данные фаги кодируют определенные факторы, активирующие комплекс Аргонавта и нуклеазы. Мы планируем идентифицировать эти факторы в дальнейшем. 3. Проанализировано влияние ДНК>РНК Аргонавтов на экспрессию определенных генов-мишеней в клетках бактерий. Показано, что Аргонавты способны подавлять активность репортерных генов за счет использования гидов плазмидного происхождения, но с низкой эффективностью. Для усиления репрессии генов необходима разработка подходов для более эффективной загрузки требуемых гидов в белок-Аргонавт в системе in vivo. 4. Продолжены исследования активности ДНК>РНК Аргонавтов в клетках человека. Получены генетические конструкции для индуцибельной экспрессии белков-Аргонавтов, в том числе, соединенных с репортерными флуоресцентными белками, получены стабильные культуры клеток, экспрессирующие белки-Аргонавты; также использована транзиентная экспрессия Аргонавтов после трансфекции. Проведены эксперименты по подавлению специфических эндогенных мРНК с использованием гидовых ДНК, вносимых в клетки с помощью трансфекции. В некоторых условиях наблюдается снижение экспрессии целевых генов, но эти эффекты невелики, требуется оптимизация системы. 5. Продолжено исследование механизмов работы открытых в ходе выполнения проекта коротких каталитически неактивных Аргонавтов, ассоциированных с нуклеазой DREN, способной расщеплять ДНК и РНК. Изучен новый Аргонавт CmeAgo из данной группы, показано, что он образует комплекс с DREN-нуклеазой, которая активируется в системе in vitro при связывании гидов и мишеней с Аргонавтом. Показано, что CmeAgo обладает коллатералльной активностью по отношению к различным ДНК и РНК-субстратам при узнавании специфических мишеней в очищенной системе и способен с высокой эффективностью защищать клетки от плазмид и фагов. 6. Начато исследование новой группы коротких каталитически неактивных Аргонавтов, ассоциированных с нуклеазами HNH-семейства. Проведен первичный биоинформатический анализ белков этой группы, выделены белки-кандидаты, показано, что белки-Аргонавты образуют стабильные комплексы с HNH-нуклеазой. Подобные системы могут быть перспективными для разработки новых подходов для детекции или деплеции нуклеиновых кислот. Детальное исследование этих систем планируется в заявке на продолжение проекта. В целом, полученные за отчетный период данные показывают, что ДНК>РНК Аргонавты являются новой иммунной системой бактерий, которая обеспечивает защиту клеток от бактериофагов. Это первый пример защитной системы с участием Аргонавтов, которая действует за счет нацеливания на фаговые РНК-транскрипты. Показано, что кодируемая овместно с этими Аргонавтами нуклеаза облдадает ДНКазной активностью, обнаружена ее возможная роль в процессинге гидовых ДНК, используемых Аргонавтами. Показана принципиальная возможность применения данной системы для направленного подавления генов, но разработанные подходы требуют дальнейшей оптимизации. Обнаружен новый класс защитных систем, состоящих из каталитически неактивных белков-Аргонавтов и ассоциированных с ними нуклеаз различных семейств, DREN или HNH. Показано, что активация таких систем может приводить к коллатеральному расщеплению ДНК и РНК-субстратов. Такая активность обеспечивает защиту клеток от фагов и плазмид и может быть использована для разработки диагностических тест-систем с высокой чувствительностью и специфичностью.

Публикации