Инженерия зондов для бимодальной флуоресцентной и магнитно-резонансной визуализации специфических сайтов геномного редактирования в живых клетках и тканях

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00205

НазваниеИнженерия зондов для бимодальной флуоресцентной и магнитно-резонансной визуализации специфических сайтов геномного редактирования в живых клетках и тканях

Руководитель Жердева Виктория Вячеславовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика

Ключевые слова геномное редактирование, эпигенетическое мечение хроматина, аптамеры, dcas9, флуоресцентные зонды, флуоресцентный имиджинг, парамагнитные мембранно-проникающие агенты, магнитно-резонансная томография, мультимодальный имиджинг

Код ГРНТИ76.03.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Актуальность проекта заключается в разработке нового междисциплинарного, не имеющего аналогов подхода для идентификации участков последовательности гена, доступных для редактирования, мечения деталей структуры близко расположенных и взаимодействующих участков хроматина, для идентификации регуляторных элементов, контролирующих экспрессию генов на сильно удаленных с точки зрения длины разделяющей их последовательности ДНК расстояниях, но близко расположенных с точки зрения трехмерной упаковки хроматина в ядре. Используемые на данном этапе подходы к исследованиям на уровне структуры геномов обладают высокой производительностью и эффективностью, и позволяют получать профили эпигенетических модификаций. В общем случае, при наличии строгих контролей эти подходы с высокой вероятностью дают возможность судить о структурных особенностях хроматина. Однако, анализ фрагментированной геномной ДНК в культуре клеток не позволяет непосредственно визуализировать взаимодействия высокого порядка и не обеспечивает точный пространственный масштаб трехмерной структуры хроматина. Более того, данный подход неприменим в случае живых систем и был изначально разработан для анализа состава взаимодействующих участков хроматина на уровне отдельных клеток. В отличие от применяемого анализа фрагментированной геномной ДНК в культуре клеток, который не позволяет непосредственно визуализировать взаимодействия высокого порядка и не обеспечивает точный пространственный масштаб трехмерной структуры хроматина, в данном проекте предлагается подход для мечения хроматина в живых системах. Новизна работы заключается в комплексном использовании: 1) рекомбинантных флуоресцентных зондов на основе генетически кодированных конструкций, экспрессия которых в клетке обусловлена механизмом с внешней регуляцией; данные зонды сконструированы с использованием пептидов внутриядерного транспорта на основе каталитически неактивных мутантов эндонуклеаз семейства Cas9 (dCas9), способных специфически взаимодействовать с последовательностью геномной ДНК. Зонды представляют собой пару химерных белков на основе ортологов dСas9 и быстросозревающих флуоресцентных белков, способных образовывать FRET-пары, для картирования отдельных участков ДНК, предназначенных для дальнейшего редактирования. 2) рекомбинантных флуоресцентных зондов на основе белков dСas9, которые способны специфически связывать соответствующие аптамер - несущие малые РНК в клетках с образованием ДНК-связанного рибонуклеопротеина. При введении пары нефлуоресцирующих мембранопроницаемых органических молекул - производных парамагнитных зондов - ортологи dCas9 после связывания и образования флуорофора способны образовывать FRET пару в ядрах клеток, а также могут быть детектированы методом магнитно-резонансной томографии с целью обнаружения экспрессии аптамер-несущих малых РНК в экспериментальных моделях. Таким образом, ожидаемым результатом работы по проекту будет картирование изображений эукариотических геномов с применением культуры клеток (таргетинг теломер, амплифицированных онкогенов) и на животных, в присутствии/отсутствии специфической гидовой РНК, с визуализацией методами магнитно-резонансной томографии тканей, в которых идет экспрессия аптамеров в составе гидовых РНК при использовании нетоксичных, мембранопроникающих предшественников флуорофоров, способных нести метки для их обнаружения с применением биохимических и томографических подходов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Малошенок Л.Г., Абушинова Г.А., Рязанова А.Ю., Брускин С.А., Жердева В.В. Visualizing the Nucleome on the Basis of the CRISPR–Cas9 System: From in vitro to in vivo Biochemistry (Moscow), в Т.88, выпуск 1, Suppl., 2023 г (год публикации - 2023)
10.1134/S0006297923140080

Публикации

1. Малошенок Л.Г., Абушинова Г.А., Рязанова А.Ю., Брускин С.А., Жердева В.В. Visualizing the Nucleome Using the CRISPR–Cas9 System: From in vitro to in vivo Biochemistry (Moscow), Vol. 88, Suppl. 1, pp. S123-S149 (год публикации - 2023)
10.1134/S0006297923140080

2. Малошенок Л.Г., Абушинова Г.А., Казачкина Н.И., Богданов А.А., Жердева В.В. Tet-Regulated Expression and Optical Clearing for In Vivo Visualization of Genetically Encoded Chimeric dCas9/Fluorescent Protein Probes Materials MDPI, Vol 16(3), p. 940 (год публикации - 2023)
10.3390/ma16030940

3. Богданов А.А., Тучин В.В., Казачкина Н.И., Жердева В.В., Малошенок Л.Г., Тучина Д.К., Меерович И.Г., Соловьев И.Д., Савицкий А.П. Clinical MRI contrast agent improves fluorescent imaging of red fluorescent protein expression in-vivo due to the effect of tissue optical clearing PROCEEDINGS VOLUME, 12378, Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics XX, 1237806 (год публикации - 2023)
10.1117/12.2648493

4. Жердева В.В., Богданов А.А., Абушинова Г.А., Малошенок Л.Г. Registration of low-intensity fluorescence in subcutaneous xenografts: from problems to their solutions Abstracts of the 30th International Conference on Advanced Laser Technologies, BI-22 Advanced Laser Technologies (год публикации - 2023)

5. Абушинова Г.А., Малошенок Л.Г., Жердева В.В. Optical clearing for fluorescence visualization of dCas9/FP expression in tumor subcutaneous xenografts in mice Problems of Optical Physics and Biophotonics, материалы Международного симпозиума и Международной молодежной научной школы Saratov Fall Meeting 2023 / под ред. Г. В. Симоненко, В. В. Тучина. – Саратов : Изд - во «Новый ветер» (год публикации - 2024)

6. Н.В. Булатенко, А.Ю. Рязанова, А.Р. Лихов, С.А. Брускин, Л.Г. Малошенок, В.В. Жердева Tumor organoids: the era of personalized medicine Biochemistry (Moscow), том 89, выпуск Supplement 1 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924140086

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Tet-On зависимая индукция экспрессии химерных флуоресцентных конструкций (dCas9-FP) была успешно продемонстрирована как в клеточной культуре, так и на модели ксенографтов аденокарциномы лёгкого человека A549 на мышах линии nude. Однако на модели подкожных ксенографтов, созданных на основе клеток остеосаркомы человека MNNG/HOS, были выявлены ограничения индуцибельной экспрессии трансгенов dCas9-FP. Подавление экспрессии трансгена в некоторых случаях наблюдалось в культуре сгенерированных из клеток опухоли 3D-сфероидов. При анализе морфологии отдельных субклонов dCas9-FP были обнаружены отличия от исходной клеточной линии. Отмечался очаговый плотный рост колоний, сопровождающийся изменением клеточных полигональных форм на более округлые. В ряде случаев это сопровождалось остановкой деления клеток. Было показано, что лентивирусная трансдукция с последующим отбором единичных клеток с высоким уровнем экспрессии трансгена может приводить к изменению клеточного генотипа и фенотипа. Это характеризуется снижением пролиферативного индекса, удлинением клеточного цикла, снижением наработки транскриптов актина и тубулина (ACTB и TUBB3), а также снижением туморогенности в мышах nude. Вероятнее всего, это результат нелетального инсерционного мутагенеза, вызванного многокопийной встройкой в регуляторные области, которые прямо или косвенно регулируют транскрипцию генов. Эти результаты подчеркивают сложность и многофакторность процессов, происходящих при трансдукции и отборе клеток с индуцибельной экспрессией трансгенов. Они также указывают на необходимость дальнейшего изучения механизмов, влияющих на клеточный генотип и фенотип, чтобы более эффективно использовать индуцибельные системы для терапевтических целей. Были получены данные по распределению флуоресцентных химер dCas9-FP в ядерных компартментах, а также в локусах мечения теломер. При этом для всех изученных химерных ортологов наблюдается неспецифическое накопление химер в ядерных тельцах, характеризующееся снижением времени жизни на 10-15% по сравнению с несвязанными химерами. При анализе времени жизни доноров и акцепторов химерных молекул продемонстрировано, что условия FRET соблюдаются для гомологичной комбинации пар ортологов sp/sp при их неспецифическом накоплении в ядерных тельцах. Проведено тестирование аптамеров tdBroccoli и MangoIV с гидовыми РНК и показано, что они обладают сродством к меткам DFHBI и DFHBI1 /ТО3/YO3. Показано многократное усиление флуоресценции красителя при связывании с аптамерами и преимущественным накоплением в ядрышках. Получение гибридных флуоресцентно-парамагнитных меток ТО3/YO3-SNTO будет использовано для совмещения флуоресцентного сигнала с морфологическими участками органов и тканей, что позволит с высокой чувствительностью визуализировать геномные локусы in vivо. Т

Публикации

1. Рассомахина Н.В.., Абушинова Г.А, Жердева В. В. , Малошенок Л.Г. Generation and visualization the 3D mice-derived tumor organoids, expressing dcas9-FP probes Conference Proceedings SFM (год публикации - 2024)

2. Жердева В.В., Рассомахина Н.В., Монахова М.В., Юркова А.Ю., Гук Е.А., Апухтина У.А., Малошенок Л. Г. Снижение экспрессии генов цитоскелета в опухолевых клетках при лентивирусной трансдукции Молекулярная генетика, микробиология и вирусология (год публикации - 2025)

3. Абушинова Г.А., Жердева В.В., Васина Е.М., Малошенок Л.Г. Visualizing Nucleic Acid Loci with the CRISPR-Cas System: Current Approaches Journal of Biomedical Photonics & Engineering (год публикации - 2024)

4. Абушинова Г.А, Жердева В. В. , Малошенок Л.Г. Разработка флуоресцентных зондов на основе dCas9 и флуоресцентных белков, способных образовывать FRETпары, для визуализации геномных локусов МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС «VIII Сьезд Вавиловского общества генетиков-селекционеров, посвященный 300‑летию российской науки и высшей школы » Саратов 14–19 и ю н я 2024 г о д а. Сборник тезисов. Межрегиональная общественная организация Вавиловское общество генетиков и селекционеров (ВОГиС), 2024, Международный Конгресс «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300‑летию российской науки и высшей школы». Саратов, 14–19 июня 2024 года | Издательский дом «Петрополис», Санкт‑Петербург, 2024. — 804 с. Межрегиональная общественная организация Вавиловское общество генетиков и селекционеров (ВОГиС), 2024 © Коллектив авторов, 2024 © ИД «Петрополис», 2024 стр.458 Разработка флуоресцентных зондов на основе dCas9 и флуоресцентных белков, способных образовывать FRETпары, для визуализации геномных локусов (год публикации - 2024)

5. Абушинова Г.А, Жердева В. В. , Малошенок Л.Г. Метод прижизненной визуализации локусов генома флуоресцентными сенсорами на основе семейства эндонуклеаз dCas9 ХОЛОЭКСПО 2024 XXI Международная конференция по голографии и прикладным оптическим технологиям (Казань, 9–13 сентября 2024 года) Тезисы докладов, XXI Международная конференция по голографии и прикладным оптическим технологиям (Казань, 9–13 сентября 2024 года) : тезисы докладов / Общество с ограниченной ответ- ственностью «Холоэкспо наука и практика». — Москва : Издательство МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2024. — 398 с. : ил. Г. А Абушинова, В. В.Жердева, Л. Г. Малошенок, Метод прижизненной визуализации локусов генома флуоресцентными сенсорами на основе семейства эндонуклеаз dCas9 с.335-336 (год публикации - 2024)

6. Малoшенок Л.Г., Абушинова Г.А., Казачкина Н.И., Богданов мл. А.А,, Жердева В.В. Разработка подходов по бимодальной визуализации in vivo сенсоров на основе dCas9 и флуоресцентных цветных белков Под редакцией А.Г. Габибова, М.А. Островского, Р.И. Сепиашвили _III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ ♦ VII СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ ♦ VII СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ ♦ X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ» (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2022). НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 3. – М.: Издательство «Перо», 2022. – с.129, Под редакцией А.Г. Габибова, М.А. Островского, Р.И. Сепиашвили III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ ♦ VII СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ ♦ VII СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ ♦ X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ» (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2022). НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 3. – М.: Издательство «Перо», 2022. – с.129 (год публикации - 2022)

Возможность практического использования результатов
5.9. Возможность практического использования результатов проекта в экономике и социальной сфере Проект нацелен на разработку инновационных методов, которые могут быть использованы для ранней диагностики генетических заболеваний и онкологических заболеваний. Разработка технологий визуализации с использованием системы CRISPR/Cas9, а также бимодальных зондов для магнитно-резонансной томографии и флуоресцентной визуализации создаст основу для создания новых диагностических систем, например, на основе 3D-персонализированных тканеспецифических органоидов , в том числе тумороидов. Это обеспечит переход диагностики на прецизионный уровень. При этом позволит решать не только прикладные, но и фундаментальные вопросы по выяснению механизмов канцерогенеза, поиска как таргетных, так и иммунотерапевтических подходов для прецизионного лечения заболеваний. Сочетание МРТ и флуоресцентной визуализации на основе разработанных методов мечения локусов генома на основе инактивированных эндонуклеаз Cas 9 позволят вплотную подойти к изучению роли нуклеома на тканеспецифичных и прецизионных моделях пациентов. Таким образом, результаты проекта могут способствовать экономическому росту и социальному развитию через развитие новых технологий и продуктов, улучшая доступность и качество медицинской помощи. В перспективе результаты проекта могут стать основой для создания комплекса новых биотехнологий и медицинских решений, что окажет существенное влияние на развитие науки, здравоохранения и экономики страны.