Разработка и создание системы направленной доставки белковых препаратов для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний на основе внеклеточных везикул

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00219

НазваниеРазработка и создание системы направленной доставки белковых препаратов для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний на основе внеклеточных везикул

Руководитель Ломакин Яков Анатольевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова Аутоиммунные заболевания, белковые наноконтейнеры, рассеянный склероз, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, внеклеточные везикулы, направленная доставка, основной белок миелина, презентация антигена, HER2, ГКГС II, аутоантиген, дендритные клетки, индукция толерантности, пептидные вакцины, иммунотолерантность.

Код ГРНТИ34.15.33

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Стремительное развитие современной биомедицины обусловлено созданием терапевтических препаратов, обладающих высокой селективностью и низкой токсичностью. Появление таких препаратов требует не только разработки высокоактивных терапевтических компонентов, но и обеспечение их эффективной доставки к определенным органам, тканям и клеткам-мишеням. Безусловным успехом в области доставки препаратов на основе рибонуклеиновых кислот к иммунным клеткам стали вакцинные препараты против COVID – 19 (Pfizer-BioNTech, Moderna). Существенный прогресс в области адресной доставки препаратов достигнут благодаря использованию таргетированных наночастиц и антитело-направленной терапии. Недавние прорывные открытия генной инженерии делают возможным создание инновационного генетически кодируемого препарата на основе внеклеточных везикул (ВВ), нагруженных терапевтическим агентом белковой природы. Использование ВВ в качестве носителей белковых молекул обладает рядом преимуществ: (1) природная биосовместимость мембраны клетки-мишени и мембраны ВВ, (2) способность ВВ проникать через гематоэнцефалический барьер, (3) возможность прогнозируемого изменения белкового состава мембраны ВВ. Модификация белкового профиля мембран ВВ позволяет осуществлять адресную доставку терапевтического содержимого ВВ внутрь желаемых клеток-мишеней. Использование аутологичных клеток человека в качестве клеток-продуцентов ВВ позволит совершить переход в сторону персонализированной медицины. Данный подход может стать основой для разработки новых методов терапии огромного спектра патологий - аутоиммунных, онкологических и вирусных заболеваний. В рамках данного проекта планируется разработка и создание препаратов для терапии аутоиммунных заболеваний на примере рассеянного склероза (РС), и онкологической патологии – на примере рака молочной железы (РМЖ). Имеющиеся в арсенале врачей препараты для терапии РС на данный момент способны лишь замедлить развитие заболевания, не приводя к полному выздоровлению пациентов. Часто данные препараты действуют неспецифично и вызывают серьезные побочные эффекты. В этом свете разработка высокоспецифичных препаратов нового поколения для терапии аутоиммунных патологий приобретает первоочередное значение. В качестве терапевтического агента разрабатываемого препарата на основе ВВ планируется использовать иммунодоминантные фрагменты основного белка миелина (ОБМ) или миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) – одних из главных мишеней аутоиммунной атаки при РС. Данные фрагменты ОБМ, упакованные в маннозилированные липосомы (Ксемус), уже показали свою эффективность в ходе проведение 2 этапа клинических испытаний. Однако для терапии РС препарратом Ксемус необходимо его пожизненное применения пациентами. Генетически кодируемые ВВ, нагруженные терапевтическими фрагментами ОБМ или МОГ, при использовании аутологичных клеток пациентов могут увеличить эффективность доставки, привести к более специфической терапии РС и существенно улучшить качество жизни пациентов. Рак молочной железы (РМЖ), в свою очередь, является самым распространенным онкологическим заболеванием среди женщин во всем мире. Большинство классических подходов в адъювантной терапии РМЖ, такие как химиотерапия цитостатическими препаратами и лучевая терапия, не являются специфическими в отношении раковых клеток и, поражая в том числе и здоровые клетки организма, существенно влияют на уровень и продолжительность жизни людей с РМЖ. Имеется множество доказательств первостепенной роли противоопухолевого иммунитета в терапии рака молочной железы. Одной из основных мишеней для иммунотерапии рака молочной железы является рецептор HER2. В последние годы активно изучается возможность использования вакцин на основе иммунодоминантных пептидов данного рецептора для терапии РМЖ. Такие вакцины показали свою безопасность и терапевтический потенциал, однако нуждаются в существенной доработке из-за недостаточного уровня эффективности. Использование генетически-кодируемых таргетированных внеклеточных везикул может существенно улучшить эффективность пептидных вакцин, так как позволит более точно перенаправлять иммунный ответ против раковых клеток. В ходе выполнения данного проекта планируется использовать таргетированную доставку терапевтических пептидов внутри внеклеточных везикул к антиген-презентирующим клеткам (АПК) - дендритным клеткам и макрофагам - и показать возможность активации иммунного ответа через презентацию иммунодоминантных пептидов в составе главного комплекса гистосовместимости (ГКГС I и/или ГКГС II класса). Это становится возможным за счет направленной доставки терапевтического препарата в эндосомы антиген-презентирующих клеток, либо непосредственно в цитоплазму клетки-мишени. Предлагаемый нами подход объединяет в себе достоинства пептидных вакцин и гибкость генной терапии, а также на данный момент не имеет аналогов. Результаты проекта станут основой для разработки новых подходов в терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Овчинникова Л.А., Залевский А.О., Ломакин Я.А. Extracellular Vesicles in Chronic Demyelinating Diseases: Prospects in Treatment and Diagnosis of Autoimmune Neurological Disorders Life, Life 2022, 12(11), 1943 (год публикации - 2022)
10.3390/life12111943

2. Л.А. Овчинникова, С.С. Джелад, Т.О. Симанив, М.Н. Захарова, Я.А. Ломакин, А.Г. Габибов Создание панели биомаркеров для различия пациентов с рассеянным склерозом от других неврологических заболеваний. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни (год публикации - 2024)

3. Овчинникова Л.А., Елисеев И.Е., Джелад С.С., Симанив Т.О., Климина К.М., Иванова М., Ильина Е.Н., Захарова М.Н., Иллариошкин С.Н., Рубцов Ю.П., Габибов А.Г., Ломакин Я.А. High heterogeneity of cross- reactive immunoglobulins in multiple sclerosis presumes combining of B-cell epitopes for diagnostics: a case-control study Frontiers in Immunology, Volume 15 - 2024 (год публикации - 2024)
https:10.3389/fimmu.2024.1401156

4. Овчинникова Л.А., Таныгина Д.Ю., Джелад С.С., Евтушенко А.Г., Багров Д.В., Габибов А.Г., Ломакин Я.А. Targeted macrophage mannose receptor (CD206)-specific protein delivery via engineered extracellular vesicles Heliyon, Volume 10, Issue 24, e40940 (год публикации - 2024)
10.1016/j.heliyon.2024.e40940

5. Ишина И.А., Жиянов А.П., Курбацкая И.Н., Мамедов А.Э., Нерсисян С.А., Зиганшин Р.Г., Елисеев И.Е., Петрусенко Ю.С., Никонова А.В., Жбанова Е.С., Сальникова М.А., Овчинникова Л.А., Мамедов И.З., Давыдов А.Н., Нурбаева К.С., Лисицина Т.А., Решетняк Т.М., Лила А.М., Насонов Е.Л., Ломакин Я.А., Белогуров А.А., Жанг Х., Тоневицкий А.Г., Рубцов Ю.П., Габибов А.Г., Захарова М.Ю. Autoantigenic peptide landscape of rheumatoid arthritis-associated HLA class II Genes and diseases (год публикации - 2024)
10.1016/j.gendis.2024.101469

6. Овчинникова Л.А., Ломакин Я.А. Внеклеточные везикулы в диагностике онкологических заболеваний ActaNaturae (год публикации - 2025)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
- Для презентации пептидов на поверхности антиген-презентирующих клеток (АПК) в составе MHCI необходимо, чтобы эндогенный белок был гидролизован протеасомой с генерацией тех самых пептидов, которые и будут загружаться на MHCI. Поэтому для таргетированной доставки белков с помощью внеклеточных везикул (ВВ) в АПК с последующей презентацией заданных пептидов на поверхности клетки-мишени в комплексе с MHCI крайне важно наличие на доставляемом белке N-концевой аминокислотной последовательности, узнаваемой клеточной протеасомой. В предыдущие годы выполнения Проекта использовалась система, в которой для обеспечения направленной загрузки белковой кассеты внутрь ВВ на С-конце доставляемого белка добавляется домен белка Jun, взаимодействующий с доменом Fos, который в свою очередь входит в состав наноконтейнеров EPN (третьим компонентом данных везикул является белок VSV-G, отвечающий за формирование ВВ, наполненных наноконтейнерами EPN). По результатам биоинформатического анализа было обнаружено, что последовательность Jun обладает высоким сродством для захвата протеасомой. Поэтому для увеличения вероятности доставляемого белка процессироваться протеасомой с генерацией 9-членных пептидов, которые затем будут презентироваться в комплексе с MHCI, были созданы генетические конструкции, где Jun-домен находится на N-конце доставляемого белка. В модельной системе в качестве доставляемого белка использовали люциферазу NanoLuc. В результате была показана принципиальная возможность использования Jun-домена на N-конце доставляемого белка, однако при этом эффективность и загрузки ВВ, и доставки белка внутрь клеток-мишеней уменьшается в 1,5 – 2 раза по сравнению с доставкой белковой кассеты с C-концевым Jun-доменом. - Для оценки возможности использования ВВ для доставки белков внутрь АПК с последующей презентацией желаемых пептидов в составе MHCI использовали модельную систему, состоящую из клеток-презентеров и репортерных Т-клеток разработанную ранее в лаборатории сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН (под руководством Звягина И.В.). Использованная в данной серии экспериментов система включала три компонента: (1) модельный пептид NLV; (2) модельные АПК - клетки линии K562, экспрессирующие рекомбинантный MHCI, способный связывать и презентировать пептид NLV; (3) клетки Jurkat, несущие рекомбинантный Т-клеточный рецептор, узнающий данный пептид NLV. При связывании данного рекомбинантного Т-клеточного рецептора с комплексом пептид-MHCI в модельных Т-клетках индуцируется экспрессия флуоресцентного белка GFP. Для повышения количества загружаемого пептида внутрь ВВ и увеличения эффективности внутриклеточной доставки с использованием ВВ были созданы генетические конструкции, содержащие 6 тандемных повторов, кодирующих эпитоп NLV. На N-конце данной белковой кассеты находятся Jun-домен для захвата белка протеасомой. На первом этапе была проверена функциональность конструкции путем трансфекции полученных модельных АПК и оценки распознавания эндогенно синтезирующихся эпитопов путем ко-культивации с модельными Т-клетками. Было показано, что транслируемый белок с 6 тандемными повторами и N-концевым Jun-доменом в принципе может служить источником эпитопов NLV, презентируемых на поверхности АПК в составе MHCI. Далее непосредственно на препарате ВВ, загруженных пептидами NLV, была показана возможность доставки целевых белков внутрь АПК с последующей презентацией эпитопа в составе MHCI и активацией модельных Т-клеток. Для подтверждения доставки эпитопа NLV именно внутри ВВ на ряду с грубо очищенным препаратом ВВ (концентрирование на Amicon 100 кДа) в эксперименте проверялись также препараты ВВ, прошедшие дополнительный этап очистки с помощью гель-фильтрации. В результате нами впервые была показана принципиальная возможность доставлять таргетируемый белок в составе генетически кодируемых ВВ внутрь АПК, с последующей презентацией заданных эпитопов в составе MHCI. - Для подтверждения важности антигенов, определенных в предыдущий год выполнения Проекта, было показано, что уровень антител к фрагментам белков SPTAN1 и LMP1 коррелирует в крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у пациентов с РС, но не у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС). Методом ИФА был измерен титр IgG, специфически связывающих SPTAN1 (Spectrin alpha chain non-erythrocytic 1), protein-tyrosine kinase (PTK6), periaxin (PRX) и LMP1, в парных образцах ЦСЖ и периферической крови пациентов с РС и контрольной группе – пациентов с БАС. Таким образом, мы подтвердили важность SPTAN1 и LMP1 в формировании аутоиммунного ответа у группы пациентов с РС. - Было проведено исследование по поиску пептидов, которыми потенциально можно загружать ВВ для терапии другого аутоиммунного заболевания – ревматоидного артрита (РА). Для определения новых иммунодоминантных пептидов, ассоциированных с РА, был проведен поиск аутоантигенных пептидов, представленных в составе HLA-DRB101:01 и HLA-DRB104:01 - аллелей класса II человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), имеющих сильную корреляцию с предрасположенностью к РА. Путем комбинации двух параллельных подходов: фагового дисплея и анализа иммунно-пептидома периферических АПК пациентов с РА с использованием жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), были идентифицированы следующие аутоантигены - фрагменты аннексина A11, шаперона эндоплазматического ретикулума BiP, калретикулина и виментина. В результате было продемонстрировано, что фрагмент аннексина A11, в комплексе с HLA-DRB1*01:01, способен активировать CD4+ T-клетки у пациентов с РА, но не у здоровых доноров. Таким образом, был определен новый аутоантигенный пептид, который предполагается доставлять в АПК для формирования иммуннотолерантности у аутореактивных Т-клеток для терапии РА.

Публикации

Возможность практического использования результатов
При дальнейшей оптимизации системы доставки белковых препаратов с использованием внеклеточных везикул возможно добиться целенаправленного моделирования иммунного ответа, что крайне востребовано при лечении аутоиммунных и онкологических заболеваний.