Роль NeuroD2/6 и WWP1/2 в формировании кортико-кортикальных связей

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00232

НазваниеРоль NeuroD2/6 и WWP1/2 в формировании кортико-кортикальных связей

Руководитель Бабаев Алексей Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" , Нижегородская обл

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-106 - Биология развития

Ключевые слова NeuroD2/6, WWP1/2, кортико-кортикальные связи, навигация аксонов

Код ГРНТИ34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Кора головного мозга является венцом эволюции млекопитающих. Она отвечает за абстрактное мышление и другие высшие когнитивные способности, которые отличают человека от других приматов. Нарушение развития коры приводит к широкому спектру патологий у человека, которые называются пороками развития коры головного мозга (Malformations of Cortical Development, MCD). Обмен информации между нейронами разных полушарий головного мозга необходим животным с билатеральной нервной системой. Пучки аксонов, называемые комиссурами, пересекают среднюю линию больших полушарий мозга для того, чтобы координироватъ задачи, требующие прямого обмена информацией между разными регионами коры. Мозолистое тело (СС) - самая большая комиссура в организме человека, содержащая около 80% комиссуральных аксонов всего головного мозга. Мозолистое тело в большой степени отвечает за эффективность разных аспектов высшей нервной деятельности, включая функцию исполнения решений, социальное взаимодействие, память и язык. Частичная или полная потеря мозолистого тела называется агенезией мозолистого тела (agenesis of the corpus callosum, АСС) и встречaется в более чем 70 врожденных синдромах у человека. АСС может быть вызван множеством факторов и может присутствовать либо в чистом виде, либо в сочетании с другими врожденными синдромами. В течение последних десятилетий было идентифицировано много генов, которые необходимы для нормального формирования мозолистого тела (Donahoo and Richards 2009). Большинство из них контролируют слияние полушарий головного мозга в процессе развития в районе средней линии или пересечение средней линии аксонами мозолистого тела (Fenlon and Richards 2015). Однако очень мало известно о механизмах, которые непосредственно контролируют начальные этапы роста и навигации аксонов мозолистого тела в ипсилатеральной коре. Существует два транскрипционных фактора Satb2 и NeuroD2/6, роль которых в начальной фазе роста аксонов была открыта в нашей лаборатории (Britanova et al., 2008; Srivatsa et al., 2014, Bormuth et al., 2013). В последние несколько лет нами были идентифицированы молекулярные каскады зависимые от активности Satb2, которые необходимы для инициации роста аксонов мозолистого тела. В частности, в процессе выполнения проекта РНФ, 19-14-00345, было показано, что Sema7A является ключевым белком необходимым для инициации роста ахонов мозолистого тела. Однако следующий после инициации этап формирования мозолистого тела, - навигация аксона по направлению к средней линии больших полушарий мозга и пересечение её, не до конца изучен. В частности, нам удалось не только показать, что транскрипционая активность хотя бы одного из двух транскрипционных фактора семейства NeuroD: NeuroD2 и NeuroD6, абсолютно необходима для этого процесса, но и идентифицировать один из белков, EfnA2, играющих важную роль в этом процессе. Тем не менее ключевые молекулы необходимые для навигации аксонов в сторону средней линии больших полушарий так и не были найдены и изучены. Недавно нами также было обнаружено неожиданное сходство фенотипов NeuroD2 и NeuroD6 двойного нокаута и двойного нокаута убиквитин лигаз WWP1 и WWP2. В частности, у мышей с двойным нокаутом по генам WWP1 и WWP2, также как и у мышей с двойным нокаутом по генам NeuroD2 и NeuroD6 наблюдается агенезия мозолистого тела и аналогичные нарушения дифференцировки нейронов. Полное понимание процесса навигации аксонов коры головного мозга и формирования межполушарных связей позволит создать новые животные модели, которые можно будет использовать в качестве моделей пороков развития коры головного мозга человека вообще и ACC в частности. Это, в свою очередь, поможет понять роль мозолистого тела в функционировании мозга и поможет разработать рекомендации для постнатального лечения детей с диагнозом АСС, а также будет иметь значение для пренатальной диагностики таких пациентов. Целью данного проекта является идентификация и дальнейшее изучение молекулярного каскада активируемого транскрипционными факторами NeuroD2 и NeuroD6 и убиквитин лигаз WWP1/WWP2 в нейронах коры головного мозга. В частности, мы планируем идентифицировать и охарактеризовать гены-мишени этих транскрипционных факторов, которые необходимы для безошибочной навигации аксонов коры головного мозга, образующих межполушарные связи. Мы планируем найти гены, восстановление экспрессии которых в коре головного мозга мутантных мышей с двойным нокаутом NeuroD2 и NeuroD6, и WWP1/WWP2 приводит к восстановлению формирования мозолистого тела. Кроме того, в рамках данного проекта будет проведено исследование молекулярных и генетических взаимодействий двух молекулярных каскадов: NeuroD2/D6 и WWP1/WWP2.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тарабыкин В.С. Роль трансляции в судьбе нейронов ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, Нейротехнологии будущего: тезисы участников конференции «Нейрокампус 2022 : старт!»/ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, 2022. — 130 с. (год публикации - 2022)
10.24412/CL-36983-2022-1-8-9

2. Гавриш М.С., Тутукова С.А., Бабаев А.А., Тарабыкин В.С. Поиск мишеней NeuroD и их вклад в навигацию аксонов мозолистого тела ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, Нейротехнологии будущего: тезисы участников конференции «Нейрокампус 2022 : старт!»/ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, 2022. — 130 с. (год публикации - 2022)
10.24412/CL-36983-2022-1-141-145

Публикации

1. Вебер А.И., Партасарати С., Борисова Е., Епифанова Е., Пройснер М., Русанова А., Амброцкевич М.С., Бесса П., Ньюман А.Г., Мюллер Л., Шаал Х., Хейд Ф., Тарабыкин В. Srsf1 and Elavl1 act antagonistically on neuronal fate choice in the developing neocortex by controlling TrkC receptor isoform expression Nucleic Acids Res, 51(19):10218-10237 (год публикации - 2023)
10.1093/nar/gkad703

2. Кондакова Е.В., Гавриш М.С.,Тарабыкин В.С., Ян К. NeuroD 2/6 регулируют баланс экспрессии транскрипционных факторов, контролирующих цитоархитектуру коры головного мозга Гены и клетки, Т. 18, No 4. (год публикации - 2023)
10.23868/gc568125

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Заключительный этап выполнения проекта был всецело посвящен изучению потенциальных генов-кандидатов транскрипционных факторов Neurod2/6 dKO и убиквитин лигаз WWP1/2 dKO, принимающих участие в ключевых этапах формирования коры головного мозга. Была проведена оценка роли повышенной экспрессии Tbr2 в коре головного мозга мутантных мышей Neurod2/6 dKO и WWP1/2 dKO с помощью in utero электропорации (IUE) на стадии E14.5 эмбрионального развития, с последующим анализом на E18.5 для Neurod2/6 dKO и на P10 для WWP1/2 dKO. Длительная повышенная экспрессия Tbr2 в неокортексе Neurod2/6 dKO приводит к задержке нейронов в вентрикулярной и субвентрикулярной зонах, а также изменению спецификации нейронной судьбы. В кортикальных срезах WWP1/2 dKO на P10 с повышенной экспрессией Tbr2, также было выявлено нарушение миграции нейронов. Кроме этого, нейроны WWP1/2 dKO с Tbr2 OE имеют меньший размер сомы с менее разветвленным дендритным деревом. Для выявления эффектов снижения экспрессии Tbr2 были созданы искусственные конструкты для РНК интерференции in vivo против Tbr2 (shTbr2) и Scrambled shRNA (shScr) в качестве контроля. Перед проведением экспериментов была оценена эффективность конструктов с использованием метода вестерн-блот. IUE в мутантных мышах Neurod2/6 dKO проводили на стадии E13.5 эмбрионального развития, с анализом результатов на E18.5. Снижение экспрессии Tbr2 в коре головного мозга мышей Neurod2/6 dKO способствовало увеличению количества нейронов успешно мигрировавших в кортикальную пластинку, тем самым восстанавливая нормальную миграцию клеток. При этом, снижение экспрессии Tbr2 на стадии E14.5 в неокортексе WWP1/2 dKO, не приводило к существенным изменениям в миграции клеток. Для экспериментов по оценке повышенной экспрессии ID2 был создан плазмидный вектор pCAG-ID2, который электропорировали эмбрионам на стадии E12.5, с последующим анализом послойного распределения нейронов и количественной оценкой Tbr2-положительных клеток на E15.5 и E18.5. Было выявлено, что повышение экспрессии ID2, приводит к увеличению Tbr2-положительных клеток на E15.5 и E18.5 стадии эмбрионального развития. Генетическую репарацию мозолистого тела проводили в мутантных мышах Neurod2/6 dKO с помощью восстановления экспрессии Kcnq3, на стадии E13.5 с последующим анализом на E18.5. Повышение экспрессии Kcnq3 в коре головного мозга Neurod2/6 dKO положительно влияет на миграцию нейронов, способствуя их выходу в кортикальную пластинку, при этом снижая количество Satb2 и Ctip2-положительных клеток. Помимо этого, частичное восстановление Kcnq3 позитивно влияет на навигацию аксонов к средней линии мозга. Частичное восстановление экспрессии Sh3gl2 в коре головного мозга Neurod2/6 dKO, проведенное на стадиях E13.5 - E18.5 не оказало видимых эффектов на послойное распределение и спецификацию нейронов. Оценку электрофизиологических показателей в конусе роста нейронов после инактивации гена Kcnq3 с помощью ex utero электропорации на E15.5, проводили на первичных смешанных нейрон-глиальных культурах in vitro на 2 DIV с помощью метода patch-clamp. Однако, нейроны на 2 DIV культивирования не реагировали на входящие сигналы, поэтому мы планируем провести эксперименты на 7 DIV культивирования, когда в культурах могут возникать электрические синапсы. По результатам масс-спектрометрического анализа, проведенного на стадиях Е13.5 и Е14.5 в этом и прошлом году, нами были отобраны для дальнейшего изучения белковые молекулы расположенные на мембране, которые не изменяли уровень своей экспрессии на мембране при инактивации Sh3gl2. Все заявленные в отчетном периоде работы выполнены в полном объеме.

Публикации

1. Моторина А.О., Гавриш М.С., Тутукова С.А., Тарабыкин В.С. Роль гена Sh3gl2 в миграции и определении судьбы нейронов Биосистемы: организация, поведение, управление. Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых. , с. 243 (год публикации - 2024)

2. Охальников А.Д., Гавриш М.С., Тутукова С.А., Целис Суэскун Х.К., Тарабыкин В.С. Разработка и валидация вектора на основе CRISPR/CAS9 системы для изучения роли гена Kcnq3 в формировании мозолистого тела Сборник тезисов X Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «ВолгаМед» , с. 109-111 (год публикации - 2024)

3. Бабаев А.А., Гавриш М.С., Тутукова С.А., Охальников А.Д., Тарабыкин В.С. CRISPR/CAS9 mediated inactivation of the Kcnq3 gene causes malformation of the corpus callosum Neuroscience week 2024. Joint Conference Final Program and Abstract Book, p. 45 (год публикации - 2024)

4. Бесса П.П., Ньюман А.Г., Ян К.К., Шауб Т.Т., Данненберг Р.Р., Лайко Д.Д., Эйленбергер Д.Д., Брюне Т.Т., ТексторисТаубе К.К., Кеммлер Э.Э., Денг П.П., Банерджи П.П., Равиндран Э.Э., Прейсснер Р.Р., Розарио М.М., Тарабыкин В.C. Semaphorin heterodimerizationin cis regulates membranetargetingand neocortical wiring Nature communications, Vol. 15, No 1, p. 7059 (год публикации - 2024)
10.1038/s41467-024-51009-1

5. Охальников А. Д., Гавриш М. С., Тутукова С. А., Тарабыкин В. С. Поиск мишеней Neurod и их вклад в навигацию аксонов мозолистого тела Биосистемы: организация, поведение, управление. Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых. , С. 267. (год публикации - 2024)

6. Гавриш М.С., Охальников А.Д., Моторина А.О., Тарабыкин В.С. The role of transcription factor Neurod1 in mouse corticogenesis Neuroscience week 2024. Joint Conference Final Program and Abstract Book, p. 42 (год публикации - 2024)

Возможность практического использования результатов
Применение результатов, полученных в результате выполнения данного проекта, возможно в области биомедицины и фармакологии, здравоохранения, а также предоставления социальных услуг. Принципиально новые и фундаментальные данные о роли генов, ранее неизученных в аспектах формирования коры головного мозга и мозолистого тела на ранних этапах этапах эмбрионального развития, и принимающие участие в развитии врожденных пороков развития, внесут огромный вклад в разработку методов пренатального и преимплантационного генетического тестирования, что в значительной мере позволит улучшить качество жизни пациентов и их семей, а также своевременно диагностировать патологию и назначить ее терапевтическую коррекцию. В свою очередь, это приведет к снижению уровня инвалидизации и улучшению качества жизни, связанной с состоянием здоровья. Кроме того, полученные данные могут быть использованы в образовательной сфере для актуализации теоретических знаний в области развития коры головного мозга и нейробиологии в целом.