Низкомолекулярные модуляторы сплайсинга РНК нового поколения как потенциальные препараты для терапии глиобластомы человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00234

НазваниеНизкомолекулярные модуляторы сплайсинга РНК нового поколения как потенциальные препараты для терапии глиобластомы человека

Руководитель Шахпаронов Михаил Иванович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова глиобластома, глиома, сплайсинг РНК, трансляция, низкомолекулярные ингибиторы, H3B-8800

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Огромное количество результатов, полученных учёными за последние пол века, приблизило нас к понимаю основных принципов, а главное, логики, лежащей в основе процессов репликации, транскрипции и трансляции, однако сплайсинг РНК так и остался загадкой. Сплайсинг РНК это сложнейший процесс, на который тратятся значительные ресурсы клетки – ведь из-за наличия интронов длинна всех кодирующих транскриптов, исходно синтезирующихся с матрицы ДНК, увеличивается в десятки, а иногда и сотни раз. Однако, после синтеза РНК большая часть последовательности транскрипта вырезается и «выбрасывается», что также требует существенных энергозатрат от клетки. Почему это происходит? Более того, альтернативный сплайсинг приводит к появлению сотен тысяч, если не миллионов разнообразных изоформ, однако, на сегодняшний день, функционально значимыми считаются в лучшем случае 40 тысяч из них. Неужели, остальные 90% изоформ бесполезны? Это лишь несколько вопросов, демонстрирующих насколько мало на сегодняшний день известно о роли сплайсинга РНК в клетке. В 2004 и 2007 годах были созданы первые высоко эффективные «ингибиторы» сплайсинга РНК – Пладиенолид Б (J Antibiot (Tokyo). 2004, 57(3):180-7.) и Сплайсеостатин А (Nature Chemical Biology, 2007, 3, 576–583). Оба этих соединения взаимодействуют с одним и тем же участком пре-мРНК связывающего кармана сплайсосомного белка SF3B1 (Nature Communications, 2021, 12, 4491). В исходных публикациях данные молекулы были описаны как ингибиторы сплайсинга, однако позже стало понятно, что такое название является не совсем корректным. Дело в том, что реальное ингибирование сплайсинга происходит при концентрациях этих веществ, превышающих значение их константы диссоциации как минимум на 3 порядка (Kd ≈ 50-500 pM, а ингибирование сплайсинга наблюдается при концентрациях 10-1000 nM). При этом, в диапазоне концентраций 0.5-50 nM Пладиенолид Б и Сплайсеостатин А являются модуляторами сплайсинга, то есть, данные молекулы изменяют тип и эффективность сплайсинга, однако не ингибируют саму реакцию сплайсинга. В результате под действием наномолярных концентрация «ингибиторов» сплайсинга происходит появление огромного количества новых изоформ белков, которые обладают разнообразными эффектами на клетки. Так, нами было показано, что Пладиенолид Б в концентрации 0.5-5 нМ почти на порядок увеличивает чувствительность клеток глиобластомы и рака яичников к ДНК повреждающим агентам благодаря инактивации процессов репарации ДНК (Genome Med. 2018, 10(1): 49). С другой стороны, недавняя работа Шена и соавторов показала, что обработка Пладиенолидом Б в концентрации 2.5 нМ позволяет стабильно поддерживать in vitro культуру тотипотентных клеток мыши, способных в дальнейшем дифференцироваться во все типы клеток и тканей in vitro и in vivo (Cell. 2021, 184(11): 2843-2859). В данном проекте мы предлагаем детально исследовать влияние in vitro и in vivo разнообразных модуляторов сплайсинга РНК на полученные от пациентов культуры нейросфер глиобластомы человека. Мы планируем протестировать по меньшей мере 6 низкомолекулярных соединений, уделив особое внимание наиболее новому и, по-видимому, наиболее перспективному веществу, названному H3B-8800 (Nature Medicine, 2018, 24, 497–504). Данная молекула была впервые описана в 2018 году и в настоящее время проходит первую фазу клинических испытаний для лечения пациентов с миелоидной лейкемией (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02841540). Важно отметить, что это соединение не является коммерчески доступным и не может быть свободно получено для исследований, однако благодаря коллаборации с разработчиками H3B-8800 мы имеем необходимые количества данного вещества для предлагаемого проекта. В ходе нашего исследований мы надеемся ответить на следующие вопросы: 1) Какое влияние разнообразные «ингибиторы» оказывают на сплайсинг РНК в клетках глиобластомы и нормальных человеческих астроцитах? 2) Как изменения в сплайсинге отражаются на протеоме и фенотипе клеток? 3) Почему «ингибиторы» SF3B1, взаимодействующие с одним и тем же участком белка, обладают совершенно разным эффектом на сплайсинг РНК? 4) Можно ли с помощью ингибиторов сплайсинга увеличить чувствительность стволовых клеток глиобластомы человека к противоопухолевой терапии и/или снизить их агрессивность? 5) Могут ли ингибиторы сплайсинга быть использованы для лечения глиобластомы in vivo? Мы считаем, что успешное выполнение данного проекта прольёт свет на фундаментальные принципы, по которым альтернативный сплайсинга РНК регулирует свойства клеток, а также, впервые продемонстрирует потенциал низкомолекулярных ингибиторов сплайсинга для лечения первичных опухолей головного мозга человека.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Коваленко Т.Ф., Бхупендер Я., Ануфриева К.С., Ларионова Т.Д., Аксинина Т.Е., Латышев Я.А., Бастола С., Шахпаровнов М.И., Пандей А.К., Павлюков М.С. PTEN regulates expression of its pseudogene in glioblastoma cells in DNA methylation-dependent manner Biochimie, Volume 219, Pages 74-83 (год публикации - 2023)
10.1016/j.biochi.2023.08.010

2. А.А. Исакова, А.А. Артыков, Е.А. Плотникова, Г.В. Трунова, В.А. Хохлова, А.А. Панкратов, М.Л. Шувалова, Д.В. Мазур, Н.В. Антипова, М.И. Шахпаронов, Д.А. Долгих, М.П. Кирпичников, М.Е. Гаспарян, А.В. Яголович Dual targeting of DR5 and VEGFR2 molecular pathways by multivalent fusion protein significantly suppresses tumor growth and angiogenesis International Journal of Biological Macromolecules, Volume 255, 128096 (год публикации - 2024)
10.1016/j.ijbiomac.2023.128096

3. Ларионова Т.Д., Бастола С., Аксинина Т.Е., Ануфриева К.С., Ван Дж., Шендер В.О., .... Шахпаронов М.И., Корнблюм Х.И., Накано И., Павлюков М.С. Alternative RNA splicing modulates ribosomal composition and determines the spatial phenotype of glioblastoma cells Nature Cell Biology, Nature Cell Biology, 2022, 24(10):1541-1557 (год публикации - 2022)
10.1038/s41556-022-00994-w

4. Шендер В.О., Ануфриева К.С., Шнайдер П.В., Арапиди Г.П., Павлюков М.С., Иванова О.М., Мальянц И.К., Степанов Г.А., Журавлев Е., Зиганшин Р.Х., Бутенко И.О., Букато О.Н., Климина К.М., Веселовский В.А., Григорьева Т.В., Маланин С.Ю., Алешикова О.И. Therapy-induced secretion of spliceosomal components mediates pro-survival crosstalk between ovarian cancer cells Nature Communications, Nat Commun. 2024, 15(1):5237 (год публикации - 2024)
10.1038/s41467-024-49512-6

5. Борисевич С.С., Аксинина Т.Е., Ильина М.Г., Шендер В.О., Ануфриева К.С., Арапиди Г.П., Антипова Н.В., Анизон Ф., Эсван Ю.Ж., Жиро Ф., Татарский В.В., Моро П., Шахпаронов М.И., Павлюков М.С., Штиль А.А. The Nitro Group Reshapes the Effects of Pyrido[3,4-g]quinazoline Derivatives on DYRK/CLK Activity and RNA Splicing in Glioblastoma Cells Cancers, Cancers (Basel). 2024, 16(4): 834 (год публикации - 2024)
10.3390/cancers16040834

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Результаты, полученные в ходе первых двух лет выполнения проекта, позволили нам выбрать два наиболее перспективных ингибиторы сплайсинга РНК – FG1059 и H3B8800. Согласно нашим данным, FG1059 имеет низкую токсичностью против нормальных клеток и может быть использован как in vitro, так и in vivo. С другой стороны, H3B8800, обладая более сильным по сравнению с FG1059 эффектом против клеток глиобластомы, показывал заметную токсичность для нетрансформированных человеческих клеток. Однако, интересным свойством данной молекулы оказалось то, что H3B8800 при использовании в низких концентрациях (IC10) был способен многократно увеличивать эффективность действия темозоламида- стандартного препарата, применяемого для лечения пациентов с глиобластомой. Таким образом, в случае с FG1059, наиболее рациональным вариантом применения этого соединения кажется использование его в сравнительно высоких концентрациях (100-1000нМ) для прямой индукции гибели клеток глиобластомы, в то время как для H3B8800 более перспективным выглядит применение низких концентраций этого вещества (5-50нМ) для увеличения эффективности стандартной терапии глиобластомы. Основываясь на этих результатах, на последнем этапе данного проекта, мы детально исследовали механизм действия FG1059 на клетки глиобластомы, а также механизмы, лежащие в основе синергии H3B8800 и Темозоламида. Мы продемонстрировали, что FG1059 благодаря наличию нитро группы эффективно ингибирует киназы CLK4 и DYRK3, что не позволяет им фосфорилировать свои субстраты, главными из которых являются сплайсосомные белки. Это приводит к снижению фосфорилирования сплайсосомных белков, ответственных за узнавание 3’ сайта сплайсинга, что в свою очередь нарушает сплайсинг пре-мРНК и вызывает гибель клеток глиобластомы. Используя интракраниальные модели человеческой глиобластомы в иммунодефицитных мышах, мы показали, что внутрибрюшинная инъекция FG1059 статистически достоверно увеличивает продолжительность жизни животных и существенно уменьшает процент пролиферирующих клеток глиобластомы, а также процент стволовых клеток глиобластомы, содержащихся в опухоли. Исследуя механизм синергичного действия H3B8800 и Темозоламида, мы продемонстрировали, что наиболее вероятной причиной их синергии является способность низких концентраций H3B8800 нарушать программу сплайсинга, необходимую для активации процессов нормального ответа клетки на повреждение ДНК. Это приводит к неспособности клеток глиобластомы восстановиться после действия темозоламида и вызывает их последующею гибель.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В данном проекте мы впервые продемонстрировали возможность использования низкомолекулярных ингибиторов сплайсинга РНК в качестве препаратов для борьбы с клетками глиобластомы in vitro и in vivo. Дальнейшее усовершенствование описанных нами наиболее перспективных соединений (FG1059 и H3B8800), может позволить внедрить соответствующие препараты в медицинскую практику как для лечения глиобластомы, так и для лечения других типов раковых опухолей.