Структурно-функциональные исследования ионного канала TRPA1: от лиганд-рецепторных взаимодействий к новым анальгетикам

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00326

НазваниеСтруктурно-функциональные исследования ионного канала TRPA1: от лиганд-рецепторных взаимодействий к новым анальгетикам

Руководитель Шенкарев Захар Олегович, Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова каналы TRP, TRPA1, спектроскопия ЯМР, криоэлектронная микроскопия, взаимодействия лиганд-рецептор, анальгетики, морские анемоны, пептиды Кунитц-типа

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Боль и воспаление являются взаимозависимыми и жизненно-важными процессами для организма. Однако их переход в хроническую форму относят к патологическим и крайне нежелательным явлениям, которые сильно ухудшают качество жизни больных и требуют современного и адекватного лечения. На сегодняшний день арсенал обезболивающих средств ограничен опиоидами, нестероидными противовоспалительными препаратами и аналогами гамма-аминомасляной кислоты. Перечисленные лекарственные препараты либо недостаточно эффективны, либо обладают серьезными побочными эффектами, ухудшающими качество жизни больных и даже делающими прием этих лекарств невозможным. Таким образом, в настоящее время существует острая необходимость в новых эффективных и безопасных обезболивающих и противовоспалительных препаратах. TRPA1 представляет собой неселективный катионный канал, который отвечает за восприятие широкого спектра химических раздражителей, окислителей, низких температур, механо- и болевых сигналов, возникающих при воспалении и окислительном стрессе. Этот рецептор участвует в передаче практически всех видов болевых сигналов и играет ключевую роль в развитии воспаления, боли и ее хронизации. TRPA1 обуславливает болевые ощущения при таких хронических заболеваниях как артриты, мигрень, диабетическая нейропатия, панкреатит, заболевания кишечника, а также химиотерапия-индуцированная нейропатия, развивающаяся во время лечения онкологических заболеваний. Учитывая, что TRPA1 активен при различных патологических состояниях, ведется активный поиск и исследование его модуляторов с целью создания новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов направленного действия. В качестве прообразов таких препаратов, могут быть использованы пептидные токсины ядовитых животных, демонстрирующие высокую способность к связыванию и избирательность, обусловленные «эволюционной подгонкой» к важнейшим рецепторам организма. Однако, по сравнению с другими семействами ионных каналов, механизмы взаимодействия рецепторов TRP c полипептидными токсинами в настоящее время остаются практически неизученными. Кроме того, существует ряд фундаментальных вопросов о механизме функционирования рецептора TRPA1, на которые пока нет ответа. Так, непонятен молекулярный механизм регуляции канала ионами Ca2+ и механизм термочувствительности рецептора. Возможно, за эти механизмы отвечают VSL-домены (voltage sensor-like domains), состоящие из четырех трансмембранных спиралей (S1-S4) и гомологичные потенциал-чувствительным доменам K+, Na+ и Ca2+ каналов, однако не выполняющие функцию сенсора потенциала. Целью проекта является исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействия канала человека TRPA1 с токсинами-модуляторами и установление роли VSL-доменов в регуляции работы канала. В качестве модуляторов канала TRPA1 в проекте предлагается использовать токсины пауков ProTx-I и Pha1b, имеющие структуру цистеинового узла и, возможно, взаимодействующие с каналом в области внеклеточных петель VSL-доменов, а также два новых пептида Кунитц-типа HCIQ2с1 и НСGS1.36 из морской анемоны Heteractis crispa. В рамках проекта методами электрофизиологии будут исследованы параметры взаимодействия пептидов с TRPA1. Фармакологический потенциал пептидов будет изучен в различных in vivo моделях стимуляции боли и воспаления. Основные работы в рамках проекта будут посвящены структурно-динамическим исследованиям взаимодействующих молекул и образуемых ими комплексов. Стоит отметить, что внутримолекулярная подвижность является важным фактором, определяющим механизм работы белковых молекул и, в том числе, влияющим на эффективность взаимодействия лиганд-рецептор. Для достижения целей проекта предлагается применить комплексный подход, основанный на использовании двух мощных и комплементарных методов структурной биологии – криоэлектронной микроскопии и ЯМР-спектроскопии. Электронная микроскопия позволяет решать задачи по структурным исследованиям больших мембранных белков и их комплексов с лигандами. В тоже время ЯМР-спектроскопия – единственный структурный метод, который дает детальную информацию о внутримолекулярной подвижности пептидов и небольших мембранных белков. Важным достоинством обоих методов также является возможность проведения исследований в окружении, максимально приближенном к липидной мембране. В соответствии с диапазонами молекулярных масс, доступных для исследования различными методами, структурные работы в рамках проекта предлагается разделить на несколько параллельных подзадач. Методом ЯМР-спектроскопии будут исследованы структура и динамика молекул токсинов, отдельного VSL-домена канала TRPA1, а также их комплексов. Электронная микроскопия будет использована для установления пространственной структуры комплексов токсинов с полноразмерным каналом. Мы ожидаем, что применение такого комплексного подхода позволит получить новые уникальные данные о структурной организации и молекулярных механизмах, лежащих в основе активации и инактивации каналов семейства TRP экзогенными лигандами (токсинами), которые, в перспективе, могут быть полезны как для последующих фундаментальных исследований, так и в качестве основы для создания новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов для лечения боли и воспаления.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Люкманова Е.Н., Миронов П.А., Кульбацкий Д.С., Шулепко М.А., Парамонов А.С., Черная Е.М., Логашина Ю.А., Андреев Ю.А., Кирпичников М.П., Шенкарев З.О. Recombinant Production, NMR Solution Structure, and Membrane Interaction of the Phα1β Toxin, a TRPA1 Modulator from the Brazilian Armed Spider Phoneutria nigriventer Toxins (Basel), 15(6):378 (год публикации - 2023)
10.3390/toxins15060378

2. Миронов П.А., Шенкарев З.О. Схемы замыкания дисульфидных связей в токсинах пауков семейства Ctenidae. Сравнение с предсказаниями нейросети AlphaFold 2.0 ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ, Т. 78. № 3S. C. 13–20 (год публикации - 2023)
10.55959/MSU0137-0952-16-78-3S-3

3. Миронов П.А., Черная Е.М., Заиграев М.М., Кульбацкий Д.С., Шулепко М.А., Парамонов А.С., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О. STRUCTURE, FUNCTION, AND MEMBRANE INTERACTION OF THE PHΑ1Β CTENITOXIN, A TRPA1 MODULATOR FROM THE BRAZILIAN ARMED SPIDER Сборник трудов международной научной конференции «Актуальные проблемы развития биоорганической химии»: материалы конференции (13–14 ноября 2023 г.). — Ташкент, 2023. — 483 с, c. 50 (год публикации - 2023)

4. Шенкарев З.О., Миронов П.А., Черная Е.М., Заиграев М.М., Кульбацкий Д.С., Шулепко М.А., Парамонов А.С., Крумкачева О.А., Люкманова Е.Н. MEMBRANE-ACTIVE SPIDER TOXINS RECOGNIZING CONSERVED STRUCTURAL ELEMENTS IN P-LOOP CHANNELS RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, c. 34 (год публикации - 2023)

5. Шулепко М.А., Джан М., Живов Е.А., Кульбацкий Д.С., Парамонов А.С., Чэ Ю., Кузнецов А.В., Кирпичников М.П., Шенкарев З.О., Люкманова Е.Н. Рекомбинантная продукция, видо-специфическая активность на канале TRPA1 и важная роль N-концевой последовательности токсина ProTx-I из яда тарантула Thrixopelma pruriens Acta naturae (год публикации - 2025)

6. Кветкина А.Н., Климович А.А., Кульбацкий Д.С., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О., Лейченко Е.В. АНАЛЬГЕТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПЕПТИДА КУНИТЦ-ТИПА МОРСКОЙ АНЕМОНЫ HETERACTIS MAGNIFICA IX Молодежная школа-конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2024, c 183-184 (год публикации - 2024)

7. Коваленко Е.А., Mengdie Z., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Люкманова Е.Н. РЕКОМБИНАНТНАЯ ПРОДУКЦИЯ В КЛЕТКАХ E. coli ИНГИБИТОРА КАНАЛА TRPA1 - ТОКСИНА ProTx-I XXXVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-9 февраля, 2024, сборник тезисов, с.17 (год публикации - 2024)

8. Орешков С.Д., Миронов П.А., Коваленко Е.А., Кветкина А.Н., Меньшов А.С., Лейченко Е.В., Парамонов А.С., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О. Структура и динамика новых пептидных агонистов канала TRPA1 в мембраноподобном окружении ТРУДЫ 66-й Всероссийской научной конференции МФТИ, Москва, 1–6 апреля 2024 г., с. 40-41 (год публикации - 2024)

9. Кветкина А.Н., Климович А.А., Дерявко Ю.В., Пислягин Е.А., Менчинская Е.С., Быстрицкая Е.П., Исаева М.П., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О., Аминин Д.Л., Лейченко Е.В. Sea Anemone Kunitz Peptide HCIQ2c1 Reduces Histamine-, Lipopolysaccharide-, and Carrageenan-Induced Inflammation via the Suppression of Pro-Inflammatory Mediators International Journal of Molecular Sciences, International Journal of Molecular Sciences 26, вып. 1 (6 январь 2025 г.): 431. (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26010431

10. Люкманова Е.Н.,Шенкарев З.О. Toxins from Animal Venom—A Rich Source of Active Compounds with High Pharmacological Potential Toxins, 16(12), 512 (год публикации - 2024)
10.3390/toxins16120512

11. Коваленко Е.А., Миронов П.А., Шулепко М.А., Парамонов А.С., Заиграев М.М., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О. Построение модели комплекса TRPA1 с токсином Pha1b с учетом данных ЯМР-спектроскопии ТРУДЫ 66-й Всероссийской научной конференции МФТИ, Москва, 1–6 апреля 2024 г., с. 106-107 (год публикации - 2024)

12. Коваленко Е.А., Миронов П.А., Орешков С.Д., Шулепко М.А., Парамонов А.С., Заиграев М.М., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О. Shenkarev. Model of the TRPA1 complex with the Pha1β toxin based on NMR spectroscopy data V International School on Structural Biology, IBCh RAS, Moscow, 5-7 June, 2024, Abstract book, с. 63 (год публикации - 2024)

13. Кветкина А. Н., Орешков С. Д., Миронов П. А., Заиграев М. М., Климович А. А., Дерявко Ю. В., Меньшов А. С., Кульбацкий Д. С., Логашина Ю. А., Андреев Ю. А., Чугунов А. О., Кирпичников М. П., Люкманова Е. Н., Лейченко Е. В., Шенкарёв З. О. Sea Anemone Kunitz Peptide HCIQ2c1: Structure, Modulation of TRPA1 Channel, and Suppression of Nociceptive Reaction In Vivo Marine Drugs, 22(12), 542 (год публикации - 2024)
10.3390/md22120542

14. Люкманова Е.Н., Кульбацкий Д.С., Миронов П.А., Орешков С.Д., Парамонов А.С., Меньшов А.С., Кветкина А.Н., Климович А.А., Пислягин Е.А., Лейченко Е.В., Шенкарев З.О. Spatial structure, analgesic effects, and TRPA1 modulation of the Kunitz-type sea-anemone peptide HCIQ2c1 Toxicon, 107905 (год публикации - 2024)
10.1016/j.toxicon.2024.107905

15. Шенкарев З.О., Миронов П.А., Коваленко Е.А., Орешков С.Д., Кульбацкий Д.С., Парамонов А.С., Шулепко М.А., Заиграев М.М., Люкманова Е.Н. Structure, function, and interaction with membranes and TRPA1 channel of phα1β toxin from the brazilian armed spider Toxicon, 107906 (год публикации - 2024)
10.1016/j.toxicon.2024.107906

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект посвящен исследованию ионного канала TRPA1 – рецептора, который отвечает за восприятие химических раздражителей и температуры, участвующего в восприятии болевых сигналов и регуляции воспалительных процессов. На этапе проекта, в качестве прообраза новых анальгетиков, предлагалось изучить два токсина из яда пауков, действующих на TRPA1, ProTx-I и Pha1b и пептид HCIQ2c1 из морской анемоны. Методами электрофизиологии исследовано действие Pha1b на канал TRPA1 крысы экспрессированный в ооцитах X.laevis. Pha1b замедляет десенситизацию канала TRPA1 и увеличивает общий проходящий ток, вызванный нековалентным агонистом диклофенаком. Pha1b не блокирует пору канала, а модифицирует процесс его открытия-закрытия, возможно взаимодействуя с VSL-доменами (S1-S4). Титрование образца 15N-меченого Pha1b немеченым вариантом VSL-домена показало, что токсин может взаимодействовать с доменом в мицеллах LPPG, в том числе, и подвижной петлей Cys24-Cys35. Методами молекулярного моделирования (ансамблевый белок-белковый докинг с пост-скорингом решений и МД расчеты), с учетом экспериментальных данных ЯМР, построена модель комплекса Pha1b с открытым состоянием канала TRPA1 крысы. В модели петля Cys24-Cys35 токсина встраивается в щель между VSL-доменом одной субъединицы и участком порового домена соседней субъединицы канала. Вероятно, молекула токсина фиксирует взаимное положение доменов канала, что приводит к стабилизации открытого состояния и замедлению десенситизации. По данным о релаксации ядер 15N была охарактеризована внутримолекулярная динамика Pha1b и VSL-домена в мицеллах LPPG. Показано, что встраивание токсина в мицеллу приводит к значительному уменьшению амплитуды внутримолекулярных движений в пс-нс временном диапазоне. В случае VSL-домена, «быстрые» пс-нс движения наблюдались во внеклеточных петлях S1-S2 и S3-S4. Практически вся основная цепь домена, включая спиральные участки, характеризовалась высокоамплитудными движениями в наносекундном диапазоне. С другой стороны, «медленные» мкс-мс движения наблюдались для остатков из петель S1-S2, S3-S4 и спиралей S2 и S4. Пептид HCIQ2c1 на канале TRPA1 крысы усиливал амплитуду токов вызванных диклофенаком. Кроме того, HCIQ2c1 снижал количество «гиперактивированных» каналов TRPA1, не чувствительных к действию антагонистов и возникающих при повторных аппликациях ковалентного агониста AITC. Вероятно, HCIQ2c1 аллостерически действует на TRPA1, стабилизируя открытое состояние канала, предотвращая избыточную активацию и десенситизацию. Противовоспалительное действие HCIQ2c1 было исследовано in vitro на клеточной линии макрофагов RAW 264.7 и in vivo на мышах линии CD-1. Пептид эффективно блокировал высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума макрофагов в ответ на стимуляцию гистамином, по эффективности превосходя специфический антагонист H1-рецепторов, фексофенадин, в 10-100 раз. HCIQ2c1 ингибировал продукцию активных форм кислорода и провоспалительных медиаторов (TNF-α и 5-LO) макрофагами в ответ на их стимуляцию липополисахаридом. HCIQ2c1 снижал экспрессию провоспалительных цитокинов (IL-1β и COX-2) как in vitro, так и in vivo. HCIQ2c1 показал значительную эффективность в модели местного воспаления и отека, индуцированных введением λ-каррагинана в лапу мышей. Эффекты in vivo были сравнимы по своей эффективности с действием диклофенака. Структура и динамика HCIQ2c1 были исследованы методами ЯМР спектроскопии. HCIQ2c1 имеет структуру Кунитц-типа, состоящую из трех β-тяжей и двух α-спиралей, стабилизированных тремя дисульфидными связями. В структуре пептида выделяются две L-петли, соединенные дисульфидом. Остатки Arg16–Gly17 петли L1 формируют сайт ответственный за ингибирование трипсина и других протеаз. Петли L1 и L2, а также N- и С-концевые участки молекулы демонстрируют значительную подвижность одновременно в пс-нс и мкс-мс временных диапазонах. HCIQ2c1 взаимодействует с мицеллами LPPG за счет остатков С-концевой α-спирали. Титрование 15N-меченого VSL-домена канала TRPA1 немеченым пептидом и наоборот показало, что остатки, расположенные в области внеклеточных петель S1-S2 и S3-S4 домена, формируют сайт связывания токсина. В свою очередь токсин связывается с доменом остатками из N- и C-концевой областей, соединенных дисульфидной связью. Методами молекулярного моделирования, с учетом данных ЯМР, была построена модель комплекса HCIQ2c1 с открытым состоянием канала TRPA1 крысы. В модели пептид одновременно взаимодействует с тремя субъединицами канала, двумя участками порового домена (PD1 и PD2) и VSLD3. Вероятно, такое трехточечное взаимодействие фиксирует канал в определенном состоянии, ограничивая его отклик на действие агонистов и замедляя десенситизацию. Ингибирующая активность рекомбинантного токсина ProTx-I и его аналога, содержащего дополнительный N-концевой метионин (Met-ProTx-I), была изучена методами электрофизиологии на TRPA1 каналах крысы и человека. ProTx-I проявил большую активность по отношению к каналу крысы. При этом Met-ProTx-I демонстрировал существенно меньшую активность, что говорит о влиянии N-концевых остатков на биологические свойства токсина. Впервые методами криоэлектронной микроскопии удалось определить структуру комплекса канала TRPA1 человека с токсином ProTx-I (разрешение 2.8 Å). В электронной плотности были обнаружены 72 липидные молекулы. Были выявлены движения канала в мембране нанодиска, характеризующиеся скручиванием его структуры. ProTx-I связывался с внеклеточными S1-S2 и S3-S4 петлями VSL-домена, частично погружаясь в мембрану. Вероятно, ProTx-I блокирует работу TRPA1, стабилизируя закрытое состояние канала. При открытии канала происходит изменение положения VSL-доменов в мембране, что должно приводить к энергетически затратному погружению молекул ProTx-I в мембрану. Для апо-формы TRPA1 наблюдалось взаимодействие с каркасным белком нанодиска MSP2N2. Гидрофобная толщина TRPA1 значительно меньше равновесной толщины мембраны нанодиска, что приводит к смещению канала в участки с меньшей толщиной на краю нанодиска. Связывание токсина увеличивает гидрофобную толщину TRPA1 в области VSL-доменов, и комплекс TRPA1/ProTx-I располагается в середине мембраны нанодиска.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В настоящее время проект находится на стадии НИР, но в будущем результаты работы могут быть использованы для дизайна новых биомедицинских обезболивающих препаратов и препаратов для лечения воспалений