КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер проекта 22-14-00377

НазваниеCоздание высокоточного геномного редактора на основе системы CRISPR/Cas9 с перспективой использования в терапии наследственных и вирусных заболеваний человека

Руководитель Карпов Дмитрий Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова CRISPR/Cas9, редактирование генома, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, глутаминсинтаза, FUS, герпесвирусы, HIV-1, биомедицина

Код ГРНТИ34.15.00

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Редактирование геномов - внесение целенаправленных изменений в определенные участки ДНК - имеет множество применений и перспектив как в области фундаментальной науки, так и в биотехнологии и медицине. Используемые ранее технологии, основанные на гомологичной рекомбинации, эндонуклеазах с "цинковыми пальцами", мегануклеазах и эндонуклеазах с нуклеотид-специфичными доменами, сегодня вытеснены системами CRISPR/Cas. Системы CRISPR/Cas используется как в фундаментальной науке для изучения функций отдельных генов и глобальной архитектуры генома, так и в прикладных исследованиях (например, в биотехнологии) для получения новых штаммов-продуцентов микроорганизмов, трансгенных животных и растений. Помимо этого ведутся клинические испытания систем CRISPR/Cas в терапии вирусных и наследственных заболеваний человека. CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) представляет собой часть системы адаптивного ответа против чужеродной ДНК у прокариот и состоит из повторяющихся последовательностей, разделенных уникальными спейсерами. С целью редактирования генов и геномов модельных организмов наиболее часто используется система CRISPR/SpyCas9 из Streptococcus pyogenes. Эта система показала себя наиболее активной при редактировании эукариотических геномов и, кроме того, это наиболее детально изученная система со множеством модификаций, некоторые из которых уже проходят клинические испытания. В технологии редактирования геномов эукариот используются химерные направляющие РНК (single guide, sgРНК). Эти РНК состоят из структурной части, распознаваемой эндонуклеазой SpyCas9, и геном-специфичной части (спейсера) длиной 20 нуклеотидов, комплементарной последовательности-мишени в геноме (протоспейсеру). За счет спейсера sgРНК связываются с мишенями в геноме и, тем самым направляют на них эндонуклеазу Cas (CRISPR associated protein), которая вносит в геномную мишень двухцепочечный разрыв ДНК. Далее по месту разрыва происходит вставка доставляемого в клетку фрагмента ДНК, фланкированного последовательностями, гомологичными участкам, окружающим разрыв в целевом локусе, за счет механизма репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Все системы CRISPR/Cas, гидролизующие ДНК, требуют наличия мотива PAM (protospacer adjacent motif), примыкающего к участку мишени. Преимуществами систем CRISPR/Cas по сравнению с предшествующими технологиями редактирования генома является простота их использования и доступность даже для небольших лабораторий с невысоким уровнем финансирования. С другой стороны, ключевыми недостатками этих систем являются относительно высокая внецелевая активность - способность вызывать мутации в случайных участках генома (off-targets), последовательности которых частично комплементарны sgРНК; высокая зависимость эффективности редактирования целевых участков от геномного контекста (в частности, наличия PAM) и структуры хроматина (в областях плотно упакованного хроматина эффективность редактирования низкая); а также проблема доставки компонентов CRISPR/Cas в клетки, в т.ч. из-за относительно большого размера Cas-эффекторов. Эти проблемы ограничивают применение современных вариантов системы CRISPR/SpyCas9 в области генной терапии вирусных и наследственных заболеваний. Данный проект нацелен на решение ключевых проблем низкой специфичности и недостаточно высокой активности современных геномных редакторов на основе CRISPR/Cas9. В настоящее время есть несколько способов решения проблемы специфичности (т.е. внецелевой активности) эндонуклеазы SpyCas9. Первый подход заключается в использовании пары SpyCas9-никаз, узнающих две расположенные рядом мишени ДНК и вносящих два одноцепочечных разрыва ДНК на небольшом расстоянии друг от друга. К сожалению, при повышении специфичности, эффективность действия такой пары составляет доли процента. Второй подход заключается в использовании систем CRISPR/Cas, у которых эффекторные эндонуклеазы распознают более длинный (а, значит, более специфичный) PAM. Наконец, получен большой набор модифицированных форм белка SpyCas9 с мутациями, повышающими его общую специфичность (eSpCas9(1.1), Cas9-HF1, Hypo-Cas9, xCas9), специфичность к PAM (SpyCas9 c мутацией E1135D), и эффективность гидролиза ДНК в составе хроматина (iCas9) по сравнению со SpyCas9 дикого типа. При этом специфичность и активность SpyCas9 зачастую оказываются "в противофазе" - у высокоспецифичных вариантов SpyCas9 наблюдается пониженная активность на целевых участках генома по сравнению с белком дикого типа, т.е. снижается процент отредактированных клеток. Основной целью данной работы является получение новых форм эндонуклеазы SpyCas9 с повышенной активностью и специфичностью по отношению к целевому сайту редактирования для решения вышеописанных проблем, возникающих при применении технологии CRISPR/Cas, и анализ эффективности применения этих форм на моделях наследственных и вирусных заболеваний человека. В течение 2019 - 2021 гг. нашим коллективом была получена панель из 42-х новых форм белка SpyCas9, несущих комбинации трех групп мутаций, повышающих общую специфичность SpyCas9 (eSpCas(1.1), Cas-HF1, Hypa-Cas9, ЕvoCas9, HiFi-Cas9, Sniper-Cas9), эффективность гидролиза ДНК на нуклеосоме (D147Y и P411T) и мутации, повышающей специфичность к PAM (D1135E), см. Таблицу 1. Среди полученных новых форм обнаружены варианты со специфичностью, повышенной относительно SpyCas9 дикого типа, но при этом сохранившие высокую активность. Высокая специфичность и активность полученных высокоточных форм SpyCas9 была подтверждена в тестировании на модельной системе дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В данной работе полученные мутанты, показавшие наибольшую активность и точность редактирования на дрожжах S. cerevisiae, будут протестированы на культурах клеток человека (с использованием нескольких генов-мишеней и оценкой процента отредактированных клеток и количества внецелевых сайтов редактирования, т.е. специфичности). В качестве основного задела к проекту нами получена ранее не описанная точечная мутация LP (замена лейцина на пролин в PAM-связывающем домене SpyCas9), увеличивающая активность высокоточных форм SpyCas9 в 2 - 4 раза для некоторых sgРНК. Высокая точность модифицированных редакторов при этом сохраняется. Нами предложен механизм действия этой мутации, основанный на повышении конформационной подвижности двух остатков аргинина, участвующих в распознавании PAM. В настоящее время мы не раскрываем координаты данной аминокислотной замены, до оформления патента на полученную нами конструкцию. В предлагаемом проекте будет продолжена работа по дальнейшему повышению точности и активности полученных новых форм SpyCas9-LP с помощью замены обнаруженной ключевой аминокислоты (лейцин) на аминокислоты, относящиеся к разным группам по химическим и физическим свойствам боковых радикалов: глицин, аланин, фенилаланин, серин, глутамат, валин, глутамин и гистидин. Далее будет получена панель мутаций в ближайшем окружении ключевого остатка лейцина (как путем рационального дизайна, так и путем случайного мутагенеза). Возможно, среди этих мутаций будет найден вариант, усиливающий мутацию LP за счёт увеличения конформационной подвижности РАМ-распознающего домена. Активность и специфичность полученных мутантов будет оценена в модельных тест-системах на дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Candida glabrata. Варианты с низкой активностью и/или специфичностью будут отбракованы, а активность и специфичность наилучших вариантов будет оценена в культурах клеток человека с использованием нескольких генов-мишеней. Активность новых мутантов SpyCas9 на целевых сайтах будет определена по соотношению отредактированных/неотредактированных колоний дрожжей или клеток в культуре с применением цитометрии и количественной ПЦР, а специфичность (уровень внецелевой активности) будет оцениваться путем полногеномного секвенирования и/или выявления событий редактирования в уже известных из литературы внецелевых сайтах для данного гена-мишени с помощью ПЦР. Механизм влияния мутации LP на конформационную подвижность РАМ-распознающих остатков аргинина эндонуклеазы SpyCas9 и их взаимодействие с РАМ будет экспериментально изучен методом ЯМР- или рентгеноструктурного анализа укороченного рекомбинантного белка - мутантного РАМ-распознающего домена. Наиболее высокоточные и высокоактивные варианты SpyCas9 будут апробированы в качестве прототипов инструмента генной терапии против вирусных (вирус простого герпеса первого типа, HIV-1) и наследственных заболеваний человека (например, наследственная форма бокового амиотрофического склероза или синдром ломкой Х-хромосомы) в модельных системах in vitro.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---