Омиксные технологии для оценки генетического разнообразия белого тополя (P.alba) как основы его прикладного потенциала в условиях урбоэкосистем.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00404

НазваниеОмиксные технологии для оценки генетического разнообразия белого тополя (P.alba) как основы его прикладного потенциала в условиях урбоэкосистем.

Руководитель Большева Надежда Логиновна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые слова геномика, высокопроизводительное секвенирование, NGS, транскриптомика, омиксные технологии, дифференциальная экспрессия генов, биоинформатический анализ, биоремедиация почв, тополь, эндофиты, микробиота, метагеном, простейшие, протисты, Protista.

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на улучшение экологической ситуации в мегаполисах и минимизацию аллергических реакций у населения, вследствие плодоношения тополя (образование тополиного пуха). В проекте сделан акцент на перспективах дальнейшего применения полученных фундаментальных результатов в практике. Например, появится возможность быстрого получения более устойчивых к абиотическим факторам саженцев мужского пола, которые не образуют тополиный пух, способствующий возникновению и обострению аллергических реакций в период плодоношения дерева и существенно снижающий качество жизни горожан. В крупных городах в связи с неблагоприятной экологической ситуацией эффективное озеленение приобретает особую значимость. Идеальным городским растением можно назвать тополя (род Populus): они неприхотливы, быстро растут, легко размножаются, имеют большую листовую поверхность, эффективно поглощают углекислый газ, способствуют очистке воздуха от вредных примесей и пыли, обладают фитонцидным действием, выделяют в несколько раз больше кислорода, чем многие другие деревья, используемые в озеленении. Нельзя не отметить значимость тополя в качестве древесной культуры с высоким потенциалом использования при биоремедиации почв. Белый тополь необычайно устойчив к абиотическим факторам и почти не подвержен заболеваниям и атакам вредителей. На территории РФ он способен образовывать гибриды только с осиной, потому как другие виды из его секции произрастают далеко от ареала обитания белого тополя. Система детерминации пола P.alba обеспечивает возможность уверенной идентификации мужских особей, даже в случае гибридизации с осиной, так же как и отсутствие механизмов, позволяющих возможность смены пола в течение жизни. Помимо отработки методик и разработки протоколов, применимых и для промышленного выращивания посадочного материала белого тополя, проект ориентирован на решение большого количества исключительно научных задач. Так, до сих пор практически ничего не известно о разнообразии генотипов белого тополя (Populus alba) и его гибридов в различных регионах Российской Федерации, а также о степени генетической полиморфности некоторых участков генома, потенциально важных для разработки ПЦР тест-систем. Неизвестны границы толерантности тополя ко многим поллютантам, даже часто встречающимся в городах, например, к компонентам химических противогололедных реагентов, в которых 60-95% составляет хлорид натрия. Крайне мало известно о генетических маркерах хозяйственно-ценных признаков, например, чувствительности к ксенобиотикам, а также о фундаментальных механизмах, лежащих в их основе. В проекте используются самые передовые методы и подходы молекулярной биологии и генетики – омиксные технологии, такие как геномный, транскриптомный и метагеномных анализ. Актуальность проблемы Старение населения вследствие роста продолжительности жизни при непропорционально медленно растущем уровне ее качества приводит к росту заболеваемости в популяции. То есть возраст-ассоциированные патологии становятся все более социально-значимыми. Многие из них напрямую связаны с экологической обстановкой в регионе, и растущий уровень загрязнения окружающей среды еще больше усугубляет положение. Все чаще встречаются онкологические заболевания, патологии дыхательной и иммунной системы, а также врожденные уродства, обусловленные генетическими аномалиями. Недостаток финансирования сферы здравоохранения ощущается всё сильнее, и экономические потери государства в сложившихся обстоятельствах сложно переоценить. Крайне важно ликвидировать причины, которые ухудшают качество жизни населения, в первую очередь, вредные факторы антропогенного происхождения, поллютанты, которые в большом количестве можно обнаружить, и в воздухе, и в воде, и в земле. Возникает противоречие, связанное с тем, что основным способом очищения внешней среды является фиторемедиация, однако сами растения также провоцируют появление и обострение ряда заболеваний человека. Чаще всего наблюдается аллергическая реакция на пыльцу растений в период их цветения. Идеальным растением для фиторемедиации мог бы стать тополь, обладающий непревзойденным потенциалом устойчивости к различным абиотическим факторам, и способности метаболизировать ксенобиотики с участием сообществ прикорневых микроорганизмов. Более того, пыльца тополя почти не вызывает аллергических реакций, основные проблемы происходят из-за аллергенов, распространяющихся с тополиным пухом, образующимся при плодоношении. Однако до сих пор не удается справиться с ликвидацией в городах тополиного пуха путем кронирования деревьев, либо использования в озеленении мужских особей (либо некоторых гибридов). Частично это связано с огромной гетерогенностью популяции тополей в столице и других городах России вследствие способности тополя легко образовывать разные межвидовые гибриды и, как следствие, большой популярности тополя в середине прошлого столетия, как объекта селекционных изысканий. Практически нерешаемой проблемой для ученых является невозможность точной идентификации видовой принадлежности исследуемых экземпляров тополя, следовательно, сложности с публикацией результатов исследований. Этот факт крайне тормозит научные исследования рода Populus. В результате выполнения проекта нами будут получены важнейшие научные данные, которые не только послужат неопровержимым доказательством целесообразности и оправданности посадок белого тополя в урбоэкосистемах России, но и позволят улучшить его свойства как биоремедианта, не прибегая к геномному редактированию. Более того, научные результаты проекта послужат базисом для проектирования системы выращивания саженцев белого тополя в промышленных масштабах. Научная новизна Результаты, полученные в ходе решения поставленных задач, будут новыми для науки, и значимым для общества. На данном этапе проект имеет скорее фундаментальный характер: помимо отработки методик и разработки протоколов, применимых и для промышленного выращивания посадочного материала белого тополя, проект ориентирован на решение большого количества исключительно научных задач. Так, до сих пор практически ничего не известно о разнообразии генотипов белого тополя (Populus alba) и его гибридов в различных регионах Российской Федерации, а также о степени генетической полиморфности некоторых участков генома, потенциально важных для разработки ПЦР тест-систем. Неизвестны границы толерантности тополя ко многим поллютантам, даже часто встречающимся в городах, например, к компонентам химических противогололедных реагентов, в которых 60-95% составляет хлорид натрия. Крайне мало известно о генетических маркерах хозяйственно-ценных признаков, например, чувствительности к ксенобиотикам, а также о фундаментальных механизмах, лежащих в их основе. В проекте используются самые передовые методы и подходы молекулярной биологии и генетики – омиксные технологии, такие как геномный, транскриптомный и метагеномных анализ. В проекте сделан акцент на перспективах дальнейшего применения полученных фундаментальных результатов в практике. Например, появится возможность быстрого получения более устойчивых к абиотическим факторам саженцев мужского пола, которые не образуют тополиный пух, способствующий возникновению и обострению аллергических реакций в период плодоношения дерева и существенно снижающий качество жизни горожан. На основе фундаментальных исследований состава прикорневых и эндофитных сообществ микроорганизмов, о которых практически нет информации в литературе, потенциал применения белого тополя для биоремедиации почв может существенно расшириться. Оценка разнообразия эндофитов, исследование их роли в приживаемости деревьев и устойчивости к воздействию ксенобиотиков - новая многообещающая тематика, к которой приковано внимание научного сообщества. В то же время, достижимость задач, поставленных в проекте, не вызывает сомнения. Все задачи глубоко продуманы и детально описаны таким образом, чтобы избежать риска их невыполнения. Высокий профессиональный уровень коллектива, внушительный научный задел, большой опыт написания статей в высокорейтинговые журналы и отличная материально-техническая база ИМБ РАН являются гарантом выполнения научной составляющей проекта и указанных в нем индикаторов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Гладыш Н.С., Ковалев М.А., Ланцова М.С., Попченко М.И., Большева Н.Л., Старкова А.М., Булавкина Е.В., Кудрявцев А.А., Кудрявцева А.В. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕТЕРМИНИРОВАНИЯ ПОЛА У ТОПОЛЯ Молекулярная биология, Vol 58(2024) N 2 p. 178-191; DOI 10.1134/S0026893324020067 (год публикации - 2023)
10.1134/S0026893324020067

2. Гладыш Н.С., Богданова А.С., Ковалев М.А., Краснов Г.С., Володин В.В., Шувалова А.И., Иванов Н.В., Попченко М.И., Самойлова А.Д., Полякова А.Н., Дмитриев А.А., Мельникова Н.В., Карпов Д.С., Большева Н.Л., Федорова М.С., Кудрявцева А.В. Culturable Bacterial Endophytes of Wild White Poplar (Populus alba L.) Roots: A First Insight into Their Plant Growth-Stimulating and Bioaugmentation Potential Biology, 12(12), 1519 (год публикации - 2023)
10.3390/biology12121519

3. Ковалев М.А., Гладыш Н.С., Богданова А.С., Большева Н.Л., Попченко М.И, Кудрявцева А.В. Editing Metabolism, Sex, and Microbiome: How can we Help Poplar Resist Pathogens? Preprints.org, . (год публикации - 2023)
10.20944/preprints202312.1142.v1

4. Попченко М.И., Гладыш Н.С., Володин В.В., Богданова А.С., Краснов Г.С., Кудрявцева А.В. Materials on the history of the development of Populus alba, which grows in the European part of Russia and the Caucasus, are based on whole-genome sequencing Ин-т цитологии и генетики СО РАН; Новосиб. нац. исслед. гос. ун-т, Bioinformatics of Genome Regulation and Structure / Systems Biology (BGRS/SB-2024) : The Fourteenth International Multiconference (August 5–10, 2024, Novosibirsk, Russia) : Abstracts / Inst. of Cytol. and Genetics, Sib. Branch of the Russ. Acad. of Sci.; Novosib. State Univ. – Novosibirsk: ICG SB RAS, 2024. – XXXVI p., 2372 p. – ISBN 978-5-91291-067-8 (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-abstracts

5. Богданова А.С., Ковалев М.А., Гладыш Н.С., Попченко М.И., Краснов Г.С., Большева Н. Л., Карпов Д. С, Кудрявцева А.В. SPHINGOMONAS S6 SP. NOV. ПОТЕНЦИАЛЬНО БЕЗОПАСНЫЙ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ШТАММ-КАНДИДАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ДЕРЕВЬЕВ ТОПОЛЯ БЕЛОГО Journal of Bioinformatics and Genomics (год публикации - 2024)

6. Богданова А.С., Ковалев М.А., Гладыш Н.С., Попченкo М.И., Краснов Г.С., Полякова А.Н., Поляков Н.Б., Монастырская М.О., Жеглов Д.А., Шувалова А.И., Леонтьева М.Р., Большева Н.Л., Карпов Д.С. и Кудрявцева А.В. SPHINGOMONAS S6 SP. NOV. - ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА БЕЛЫХ ТОПОЛЕЙ Журнал "Генетика" (год публикации - 2024)

7. Ковалев М.А., Гладыш Н.С., Богданова А.С., Большева Н.Л., Попченко М.И., Кудрявцева А.В. Editing Metabolism, Sex, and Microbiome: How Can We Help Poplar Resist Pathogens? International Journal of Molecular Sciences, Kovalev, M.A.; Gladysh, N.S.; Bogdanova, A.S.; Bolsheva, N.L.; Popchenko, M.I.; Kudryavtseva, A.V. Editing Metabolism, Sex, and Microbiome: How Can We Help Poplar Resist Pathogens? Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 1308. https://doi.org/ 10.3390/ijms25021308 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25021308

8. Попченко М.И., Карпов Д.С., Гладыш Н.С., Ковалев М.А., Володин В.В., Краснов Г.С., Богданова А.С., Большева Н.Л., Федорова М.С., Кудрявцева А.В. Composition, Seasonal Dynamics and Metabolic Potential of the Rhizosphere Microbiome Associated with Wild White Poplar BioTech, Popchenko, M.I.; Karpov, D.S.; Gladysh, N.S.; Kovalev, M.A.; Volodin, V.V.; Krasnov, G.S.; Bogdanova, A.S.; Bolsheva, N.L.; Fedorova, M.S.; Kudryavtseva, A.V. Composition, Seasonal Dynamics and Metabolic Potential of the Rhizosphere Microbiome Associated with Wild White Poplar. BioTech 2024, 13, 52. https://doi.org/10.3390/ biotech13040052 (год публикации - 2024)
10.3390/biotech13040052

9. Гладыш Н.С., Ковалев М. А., Попченко М.И., Карпов Д.С., Кудрявцева А.В. УСПЕХИ ПРИКЛАДНОЙ ГЕНОМИКИ ТОПОЛЕЙ: РЕЗУЛЬТАТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РЕДАКТИРОВАНИЯ И МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА Успехи современной биологии (год публикации - 2024)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Впервые сформулирована гипотеза формирования современного ареала тополя белого. В позднем плиоцене, около 2,5 миллионов лет назад, на обширных территориях Евразии, вероятно, существовал единый ареал белого тополя. Однако, после серии оледенений в плейстоцене этот вид вымер на значительной его части, сохранившись, в частности, в трех регионах на территории России и сопредельных стран. Эти регионы, рассматриваемые нами как рефугиумы, никогда не были покрыты ледниками и соответствуют предполагаемым предковым популяциям, из которых сформировался современный ареал. Первый регион - Алтайский край и горы Центральной Азии. Второй - Закавказье. Третий регион находился на севере Африки, юге Европы и на полуострове Малая Азия. Мы назвали эти регионы Алтайско-Среднеазиатский рефугиум, Закавказский рефугиум и Южно-Европейский рефугиум. Когда ледники начали отступать, белые тополя стали распространяться за пределами этих рефугиумов. Именно третий, южноевропейский рефугиум стал наиболее важным для формирования тополей в европейской части России. Миграции из него в северо-восточном направлении привели к заселению значительной части Восточно-Европейской равнины. В то же время сухие степи и полупустыни стали естественным препятствием для распространения тополя в определенных направлениях. Он проникал в южные регионы только по долинам рек, таких как Дон, Волга и Урал. Параллельно этой миграцией на освобождающийся от сплошного оледенения территорию Предкавказья попали растения с черноморского побережья Малой Азии. Из европейской части России тополь мигрировал дальше на восток, в Западную Сибирь, внося вклад в генофонд этого региона. Основной вклад в генофонд современных популяций белого тополя на Кавказе происходит из Закавказского рефугиума. После окончания оледенения алтайско-среднеазиатский рефугиум расширился; жившие там тополя являются предками современных восточнокитайских дикорастущих растений и, в значительной степени, тополей Западной Сибири. Имела место и их миграция на запад по долинам рек лесостепной зоны, по крайней мере, на Восточно-Европейскую равнину, поскольку все растения, собранные в бассейне Дона, являются носителями алтайского генетического материала. Отдельно отметим, что хотя растения, собранные нами в Центральном федеральном округе, с одной стороны генетически близки к другим европейским популяциям, а с другой имеют определенный процент кавказских генов, в этих регионах тополя появились в результате интродукции в XIX и XX веках. Все изученные пирамидальные тополя искусственно выведены на основе европейских и кавказских генотипов, генетически относительно близки друг к другу и не имеют связей со среднеазиатскими формами. Был изменен протокол укоренения, увеличив эффективность и скорость корнеобразования в полтора раза, используя состав: ½ МС + 6-БАП 0,25 мг/л + ИМК 0,5 мг/л + 15 г/л сахароза. Увеличение ИМК до 1 мг/л вызывало морфологические нарушения и осложняло адаптацию к условиям ex vitro. Основная проблема — неспособность растений выживать при пониженной влажности, поэтому её уменьшали на 10% каждые две недели. Другой проблемой является стойкость к патогенам, поэтому растения пересаживали в стерильный почвогрунт с добавлением нестерильного. Первые две недели поливали жидкой питательной средой Хогланда для ускорения адаптации. В итоге через два месяца адаптации однолетний саженец готов к условиям ex vitro с потерями менее 10%, причины гибели — травматизация и пересыхание. Для дальнейшего улучшения устойчивости растений, в ходе исследования геномов бактерий-эндофитов корней белых тополей были обнаружены перспективные штаммы для совместного культивирования. Выбор пал на два штамма: Kocuria rosea S17 и Sphingomonas sp. S6. Образцы тополя были культивированы как в условиях in vitro, с добавлением инокулята в питательную среду, так и в условиях ex vitro, где инокулят вносился в субстрат однолетних растений в теплице с гидропонной установкой. В исследованиях использовали женские растения перспективного гибрида Populus alba x Populus tremula, популярные в озеленении. Культивирование в условиях in vitro проводили с использованием штамма Sphingomonas sp. S6 путем посева инокулята к микроклонам тополя. Для работы в условиях ex vitro применяли штамм Kocuria rosea S17 в присутствии никеля. Его вносили в субстрат растений в равных пропорциях, за исключением контрольной группы. После месяца совместного культивирования листья были отобраны для анализа дифференциальной экспрессии генов. Под влиянием колонизации тканей бактерий-эндофитом выражено усиливается, ассоциированных с путями биосинтеза белков, а также генов, функции которых связаны с реализацией световой фазы фотосинтеза; аналогично и для генов, продукты которых участвуют в метаболизме и усвоении двухвалентных металлов (железо и магний) - FRO6, MRS2B и т.д. Изменения в экспрессии последней группы генов мы связываем с непосредственным синтезом сидерофоров эндофитом и их функцией хелатирования двухвалентных металлов, что способствует усвоению этих элементов растением. Оценено влияние метилсульфурона (системного гербицида, торговое название “Магнум”) и никеля на саженцы перспективного гибрида Populus alba x Populus tremula при концентрациях половинное значение ПДК/ОДК (0,5 ПДК/ОДК), однократное значение ПДК/ОДК (1 ПДК/ОДК), трехкратное превышение ПДК/ОДК (3 ПДК/ОДК), десятикратное превышение ПДК/ОДК (10 ПДК/ОДК) в пересчете на объем субстрата. Продемонстрировано, что гибриды обладают высокой чувствительностью к гербициду в любых концентрациях, в связи с чем использование этого препарата может быть ограничено вблизи посадок тополей; на уровне транскриптома отмечено повышение экспрессии генов группы белков массовую активацию экспрессии белков теплового шока (HSP11, HS17C, HSP70, HSP83, HSP16, HSP12, HSP7C, HSP14 и др.), в том числе митохондриальных (HSP7M, HS906), хлоропластных (HS25P, HS905), а также многих других генов, связанных с ответом на стресс, включая глутатион S-трансферазы (GSTXA, GSTXC, GSTFC, GSTX6) и другие гены. В целом, на уровне транскриптома это метилсульфурон вызывает повышенную экспрессию генов, вовлеченные в пути ответа на стресс, в частности на гипоксию. Присутствие никеля даже в десятикратном превышении допустимых концентраций в почве не вызывает визуальных признаков увядания у саженцев, а скорее даже наоборот. Тем не менее на уровне экспрессии генов выражено снижение экспрессии (причем напрямую в зависимости от концентрации никеля) генов, ассоциированных с фотосинтетической активностью и организацией пластид; при этом усиливается экспрессия генов, вовлеченные в пути реакции на стресс и гипоксии, оксиредуктазной активности, активности трансмембранного транспортера ионов переходных металлов.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут быть широко использованы при планировании селекционных программ по белому тополю для целей городского озеленения. Результаты, связанные с культивированием in vitro, а также с изучением вопросов устойчивости к поллютантам, могут найти свое применение в селекционных программах по белому тополю для целей создания защитных лесонасаждений и плантационных лесных культур.