Пьезоэлементы для исследования механизмов межклеточной адгезии и создания систем экспресс-тестирования антибиотикорезистентности

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-20001

НазваниеПьезоэлементы для исследования механизмов межклеточной адгезии и создания систем экспресс-тестирования антибиотикорезистентности

Руководитель Плескова Светлана Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" , Нижегородская обл

Конкурс №66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова Антибиотикорезистентность, бактериальные штаммы, система экспресс-тестирования, атомно-силовая микроскопия, пьезосенсоры, резонансная частота, FS-спектроскопия, сила адгезии, энергия адгезии, специфические адгезионные контакты

Код ГРНТИ62.01.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Физические методы исследования давно и прочно вошли в клиническую практику. В настоящее время невозможно представить медицину без рентгеновских аппаратов, МРТ, физиолечения, микроскопических методов диагностики, радиотерапии и множества других вариантов диагностики, лечения и профилактики. Таким образом, внедрение новых объективных физических методов в медицинскую практику является важной и актуальной задачей. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является одной из разновидностей сканирующей зондовой микроскопии, которая позволяет получать нанометровое разрешение (наряду со сканирующей электронной микроскопией) при этом исследуя биологические объекты в нативной среде. Однако довольно скоро стало понятно, что АСМ является гораздо более универсальным инструментом, чем все остальные методы микроскопии: она может быть использована не только для наблюдений за живыми объектами, но и для манипуляций с ними. В частности, благодаря АСМ в настоящее время в клетку вводятся различные вещества (например, квантовые точки), извлекаются отдельные молекулы (например, РНК для генно-инженерных манипуляций), изучается сворачивание (фолдинг) и разворачивание (анфолдинг) белка с определением сил межмолекулярных взаимодействий, оцениваются упруго-механические свойства клеток и вирионов, исследуется кинетика биологических процессов (благодаря разновидности - высокоскоростной АСМ), определяется изменение рН, заряда клеток в режиме реального времени (благодаря разновидности - сканирующей ион-проводящей микроскопии), проводятся нанохирургические операции (например, разрезание вирионов с одновременным определением механических характеристик укладки нуклеиновых кислот). В настоящее время в России большое количество лабораторий получило возможность использовать атомно-силовые микроскопы, в том числе отечественного производства (NT-MDT). К сожалению, анализ русскоязычных источников показывает, что АСМ используется в основном исключительно как метод микроскопии, в лучшем случае, для определения упруго-механических свойств клеток. Поэтому развитие других вариантов использования АСМ является чрезвычайно актуальной задачей. В рамках выполнения предыдущего проекта РНФ нами была разработана новая методика определения суммарной силы и работы адгезии между двумя клетками, одна из которых фиксирована на подложке, а другая на кантилевере. Методика обладает абсолютной новизной как в отечественной, так и в мировой практике, поскольку позволяет учитывать интегральный характер межклеточных взаимодействий. Она была апробирована при исследовании силы адгезии между однотипными видами клеток (нейтрофил-нейтрофил и лимфоцит-лимфоцит). В представленном проекте методика впервые будет использована для изучения адгезионных контактов между нейтрофилами и эндотелиоцитами. Будет определена сила и работа суммарного взаимодействия между рецепторами эндотелиальной клеточной линии (эндоглином, VCAM-1, P- и E-селектинами) и соответствующими рецепторами нейтрофилов (сиалированным антигеном Льюиса или CD15, PSGL-1 и ESL-1). Определение этих параметров, а также их модуляция грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами внесет существенный вклад в реализацию фундаментальной концепции "контролируемого воспаления". Моделирование in vitro адгезионных контактов в ситуациях септицемии и септикопиемии позволит определить границы возможной регуляции воспаления и найти точки приложения для управления этим процессом, поскольку адгезия является первым и принципиальным шагом в процессе трансэндотелиальной миграции нейтрофила, определяющей эффективность проинфламматорной стратегии защиты организма. Еще более важным является решение практической задачи создания прототипа системы экспресс-тестирования резистентности к антибиотикам. Пьезосенсор, лежащий в основе механической части АСМ, может быть использован в качестве "нановесов", поскольку обладает крайне высокой чувствительностью. Здесь, в отечественных разработках ситуация более оптимистичная. В частности, две пионерские отечественные группы активно работают по данной проблематике. Это группа профессора Игоря Владимировича Яминского (МГУ им. М.В. Ломоносова) - в основном, работы связаны с использованием кантилевера как нановесов и группа профессора Юрия Дмитриевича Иванова (НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича) - в работе используют кантилеверы в качестве пьезодатчиков, для детекции микроорганизмов в оригинальной разработанной ими методике. Однако ни одна из этих групп не использует пьезосенсоры для регистрации антибиотикорезистентности. В мировой практике впервые идею использования принципа АСМ в тестировании антибиотикорезистентности высказала группа профессора S. Kasas. По сути, используется тот же принцип "нановесов", когда метаболически-активные бактерии вызывают колебания кантилевера, регистрируемые оптической системой микроскопа. S. Kasas впервые зарегистрировал увеличение амплитуды колебаний кантилевера после фиксации на нем бактерий и ее резкое снижение в случае воздействия на бактерии антибиотика, к которому данный штамм был чувствителен. В настоящее время в клинических лабораториях тестирование резистентности к антибиотикам занимает не менее трех дней. Идея, предложенная S. Kasas, позволяет снизить это время до одного часа. Однако и у созданной им системы есть существенные недостатки: (1) тестирование только одного антибиотика; (2) дороговизна метода, поскольку АСМ-микроскопы имеются на вооружении только крупных научных учреждений, а не клиник. В предложенном нами проекте использование АСМ предусмотрено только на первом этапе для отработки системы детектирования пьезосенсора, а далее будет разработан прототип прибора, который будет лишен всех перечисленных недостатков и: (1) будет мобильным и недорогим; (2) будет многоканальным и позволит одновременно тестировать резистентность к нескольким (предполагается не менее 6) антибиотикам. Создание такого прибора позволит быстро внедрить в клинику метод экспресс-тестирования (до часа) резистентности бактерий к антибиотикам, что даст возможность быстрого назначения клиницистами эффективного антибиотика и позволит в значительной степени решить проблему персистенции резистентных нозокомиальных штаммов, и увеличит эффективность лечения при инфекционных заболеваниях. Таким образом, глобальной задачей проекта является внедрение в клиническую практику еще одного эффективного физического метода диагностики антибиотикорезистентности, а сам проект обладает абсолютной новизной, фундаментальной и практической значимостью.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Плескова С.Н., Бобык С.З., Крюков Р.Н., Горшкова Е.Н., Безруков Н.А. Staphylococcus aureus Causes the Arrest of Neutrophils in the Bloodstream in a Septicemia Model Microorganisms, Pleskova S.N. Staphylococcus aureus Causes the Arrest of Neutrophils in the Bloodstream in a Septicemia Model / S.N. Pleskova, S.Z. Bobyk, R.N. Kriukov, E.N. Gorshkova, N.A. Bezrukov // Microorganisms. - 2022. - Vol. 10(9). - 1696. (год публикации - 2022)
10.3390/microorganisms10091696

2. Безруков Н.А., Плескова С.Н., Бобык С.З., Боряков А.В. High-Resolution Scanning Ion-Conductance Microscopy for the Study of Blood Cell Morphology and Rigidity Opera Medica et Physiologica, Bezrukov N.A. High-Resolution Scanning Ion-Conductance Microscopy for the Study of Blood Cell Morphology and Rigidity / N.A. Bezrukov, S.N. Pleskova, S.Z. Bobyk, A.V. Boryakov // Opera Medica et Physiologica. - 2022. Vol. 9 № 2. - P. 5-14 (год публикации - 2022)
10.24412/2500-2295-2022-2-5-14

3. Лазаренко Е.В., Плескова С.Н. Идентификация осцилляций с помощью атомно-силового микроскопа Будущее технической науки: сборник материалов XXI Всероссийской молодежной научно-техн. конф.; НГТУ им. Р.Е. Алексеева. – Нижний Новгород, 2022., Будущее технической науки: сборник материалов XXI Всероссийской молодежной научно-техн. конф.; НГТУ им. Р.Е. Алексеева. – Нижний Новгород, 2022. – С. 346-347. (год публикации - 2022)

4. Безруков Н.А., Бобык С.З., Плескова С.Н. Сканирующая ион-проводящая микроскопия для визуализации нейтрофильных гранулоцитов Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 75-й Всероссийской с международным участием школыконференции молодых ученых (Н. Новгород, 19–22 апреля 2022 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2022., Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 75-й Всероссийской с международным участием школы конференции молодых ученых (Н. Новгород, 19–22 апреля 2022 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2022. - С. 21. (год публикации - 2022)

5. Безруков Н.А., Бобык С.З., Плескова С.Н. Сканирующая ион-проводящая микроскопия для исследования морфологии и ригидности клеток крови Первая научно-практическая школа-конференция Института наук о жизни и биомедицины ДВФУ, Владивосток, 8–10 июня 2022 г. : материалы конференции. – Владивосток : Изд-во Дальневост. федерал. ун-та, 2022., Первая научно-практическая школа-конференция Института наук о жизни и биомедицины ДВФУ, Владивосток, 8–10 июня 2022 г. : материалы конференции. – Владивосток : Изд-во Дальневост. федерал. ун-та, 2022. – С. 26. (год публикации - 2022)
10.24866/7444-5334-3

Публикации

1. Плескова С.Н., Лазаренко Е.В., Безруков Н.А., Бобык С.З. Боряков А.В. Крюков К.Н. Differences in bacteria nanomotion profiles and neutrophil nanomotion during phagocytosis Frontiers in Microbiology, Front. Microbiol. 14:1113353 (год публикации - 2023)
10.3389/fmicb.2023.1113353

2. Плескова С.Н., Лазаренко Е.В., Судакова И.С., Крюков Р.Н., Безруков Н.А. Новый метод экспресс-детекции антибиотикорезистентности Прикладная биохимия и микробиология, T. 59, № 1, стр. 74-80 (год публикации - 2023)
10.31857/S0555109923010075

3. Плескова С.Н., Лазаренко Е.В., Безруков Н.А., Крюков Р.Н., Боряков А.В., Докукин М.Е., Суродин С.И. Nanomotion of bacteria to determine metabolic profile Nanotechnology and Precision Engineering, Nano. Prec. Eng. 7, 013001 (2024) (год публикации - 2024)
10.1063/10.0022171

4. Лазаренко Е.В., Плескова С.Н. Детекция нанодвижений для определения антибиотикорезистентности и метаболического профиля бактерий Будущее технической науки: XXII Всероссийская молодежная научно-техническая конференция, Будущее технической науки: сборник материалов XXII Всероссийской молодежной научно-техн. конф.; НГТУ им. Р.Е. Алексеева. – Нижний Новгород, 2023. – 566-567 (год публикации - 2023)

5. Лазаренко Е.В., Плескова С.Н. Подбор параметров сенсорного элемента для детекции нанодвижений методом атомно-силовой микроскопии Биосистемы: организация, поведение, управление: 76-ая Всероссийская школа-конференция молодых ученых. г. Нижний Новгород, Университет Лобачевского., Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 76-й Всероссийской школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 11–14 апреля 2023 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2023. 188 с. (год публикации - 2023)

6. Безруков Н.А., Плескова С.Н., Бобык С.З Динамические изменения в системе «Нейтрофильный гранулоцит – Эндотелиоцит», исследованные методом сканирующей ион-проводящей микроскопии Будущее биомедицины: IV форум молодых учёных, о. Русский – Владивосток (2023), Будущее биомедицины 2023: IV форум молодых учёных, о. Русский: материалы конференции. – Владивосток : Издательство Дальневосточного федерального университета. – с. 12 (год публикации - 2023)
10.24866/7444-5488-3

7. Безруков Н.А. Картирование ригидности эндотелиальных клеток методом сканирующей ион-проводящей микроскопии XXIX Всероссийская конференция молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины – 2023» ФБГОУ ВО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург, Материалы XXIX Всероссийской конференции молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины – 2023». – с. 167-169 (год публикации - 2023)

8. Спирина В.Ю., Рябова Н.В., Безруков Н.А., Веселова Т.А. Изучение реологических свойств эритроцитов пациентов с гипергликемией, гиперхолестеролемией и сочетанными патологиями методом акустической интерферометрии Биосистемы: организация, поведение, управление: 76-ая Всероссийская школа-конференция молодых ученых. г. Нижний Новгород, Университет Лобачевского., Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 76-й Всероссийской школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 11–14 апреля 2023 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2023. 295 с. (год публикации - 2023)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Решение фундаментальной задачи исследования межклеточных взаимодействий в модельных системах бактериемии и септикопиемии: С использованием ингибиторов протеаз методом Вестерн-блоттинга была показана возможность срезания молекул адгезии протеиназами бактериальных клеток, хотя был выявлен интересный факт, что такое срезание может осуществляться и собственными ферментами нейтрофилов, которые по всей вероятности, используют свои ферменты для самостоятельной регуляции проинфламматорных реакций. Выявлено, что в наибольшей степени активность в срезании адгезивных рецепторов СD11а нейтрофилов принадлежит бактериям E.coli 321. Генотипирование штамма выявило, в частности, наличие у бактерий факторов инвазии, которые могут быть ответственны за эту протеолитическую активность. Блокирование специфических интегринов, селектинов и адгезинов на нейтрофилах и эндотелиальных клетках клеточной линии Ea.hy 926 показало, что в срыве адгезионных межклеточных контактов в системе «нейтрофил-эндотелиальная клетка» при моделировании ситуации бактериемии (грамположительными и грамотрицательными бактериями) факторы патогенности бактерий, прежде всего, разобщают специфические рецептор-рецепторные взаимодействия, тогда как нарушение неспецифических связей играет меньшую роль в патогенезе бактериемии. Помимо ситуации бактериемии была смоделирована ситуация септицемии, когда нейтрофилы мигрируют в пиемический очаг. Методом высокоразрешающей микроскопии было показано, что нейтрофилы обнаруживают функциональную дисперсию свойств. В частности, ряд нейтрофилов могут реализовать диапедез в межэндотелиальные пространства, даже без изменения морфологии, ряд нейтрофилов, напротив, двигаются вдоль эндотелиоцитов от этих пространств, а есть нейтрофилы, которые реализуют обратную трансэндотелиальную миграцию, когда они, проходя в межэндотелиальные пространства, достаточно быстро меняют вектор движения и возвращаются в моделируемое «кровяное русло». В целом, методом проточной цитометрии было показано, что в пиемический очаг мигрирует не более 10% клеток. По всей вероятности, происходит праймирование нейтрофилов. Кроме того, наблюдаются все варианты гибели нейтрофильных гранулоцитов: апоптоз (ранний и поздний), NETоз, но преобладающим механизмом гибели является некроз. От того, какой механизм гибели преобладает, зависит степень манифестации воспалительного процесса. Практическая задача разработка экспресс-метода детекции антибиотикорезистентности: Была создана программа «Интегральная оценка нанодвижений (ИОН)» для оценки АЧХ осцилляционных колебаний кантилевера под воздействием нанодвижений бактерий, написанная в среде LabView. Благодаря разработанной программе впервые было обнаружено, что нанодвижение бактерий позволяет не только оценить метаболическую активности бактерий и оценить их чувствительность/ резистентность к антибиотикам, которые определялись по изменению амплитуды колебаний, но и обнаружить, что разные виды бактерий имеют собственные характерные частоты колебаний с существенно большей мощностью по сравнению с контролем, что позволит, при наработке должной статистики определять и видовую принадлежность микроорганизмов. Была разработана и апробирована на разных штаммах оптическая система экспресс-детекции антибиотикорезистентности. Разработанный нами в ходе реализации проекта метод имеет следующие преимущества для клинической практики: 1. Экспресс-метод (позволяет получить результат менее чем за час в отличие от диско-диффузионного метода, для которого требуется не менее 24 часов); 2. Высокочувствительный метод. 3. В режиме осцилляции можно определять видовую принадлежность бактерий. 4. Оптический метод определения чувствительности/ резистентности помимо высокой скорости анализа дешев, может использоваться в многоканальном режиме (быстрое исследование чувствительности/ резистентности к широкому спектру антибиотиков).

Публикации

1. Плескова С.Н., Безруков Н.А., Николаева Е.Д., Боряков А.В., Кузина О.В. Rapid Detection of Acinetobacter baumannii Suspension and Biofilm Nanomotion and Antibiotic Resistance Estimation Biomedicines, Biomedicines 2024, 12(9), 2034 (год публикации - 2024)
10.3390/biomedicines12092034

2. Иванова А.А., Николаева Е.Д., Плескова С.Н. Анализ антибиотикорезистентности Esherichia coli 321 методом световой оптической микроскопии XXVI Нижегородская сессия молодых ученых (технические, естественные науки). – М.: Издательство «Перо», 2024 – [Электронное издание]. (год публикации - 2024)

3. Плескова С.Н., Бобык С.З., Безруков Н.А., Лазаренко Е.В. Опсонизация бактерий изменяет адгезионные взаимодействия между эндотелиоцитами и нейтрофилами в модели экспериментальной септицемии Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2024, 177(2), 215-219 (год публикации - 2024)
10.47056/0365-9615-2024-177-2-215-219

4. Грубова О.А., Плескова С.Н. Тестирование антибиотикорезистентности A.baumannii методом осцилляции на атомно-силовом микроскопе Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2024. 425 с., Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2024. С. 99. (год публикации - 2024)

5. Плескова С.Н., Безруков Н.А., Бобык С.З., Горшкова Е.Н., Новиков Д.В. Pathogenic Escherichia coli change the adhesion between neutrophils and endotheliocytes in the experimental bacteremia model Microbial Cell, Microbial Cell 2024, 11(1), 254-264 (год публикации - 2024)
10.15698/mic2024.07.830

6. Безруков Н.А., Бобык С.З., Плескова С.Н. Staphylococcus aureus и Escherichia coli вызывают увеличение ригидности эндотелиальных клеток в модели бактеремии Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2024. 425 с., Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2024. С. 32. (год публикации - 2024)

7. Плескова С.Н., Безруков Н.А., Бобык С.З. Bacterial Nanomotion: Detection with Atomic Force Microscopy 2024 IEEE International Conference on Manipulation, Manufacturing and Measurement on the Nanoscale (3M-NANO), 2024 IEEE International Conference on Manipulation, Manufacturing and Measurement on the Nanoscale (3M-NANO), P. 361-364 (год публикации - 2024)
10.1109/3M-NANO61605.2024

8. Николаева Е.Д., Плескова С.Н. Детекция нанодвижений Acinetobacter baumannii 173-р1 методом атомно-силовой микроскопии Научные труды IX Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». ФГБНУ АФИ, Санкт-Петербург, 2–4 октября 2024 г. – СПб.: ФГБНУ АФИ, 2024. – 257 с., Научные труды IX Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». ФГБНУ АФИ, Санкт-Петербург, 2–4 октября 2024 г. – СПб.: ФГБНУ АФИ, 2024. – С. 184-185. (год публикации - 2024)

Возможность практического использования результатов
Первая разработка оценки межклеточных контактов носит фундаментальный характер, однако она может быть использована для тестирования лекарственных препаратов, регулирующих силу взаимодействия между иммунными клетками, а, следовательно, регулирующих силу воспалительного ответа. Вторая разработка очень актуальна, она может быть использована как экспресс-система для детекции антибиотикорезистентности бактерий, что будет препятствовать возникновению и распространению "супербактерий" и, таким образом, препятствовать росту заболеваемости и смертности населения Российской Федерации от таких инфекций.