Перепрограммирование клеток жировой ткани с использованием аденоассоциированных вирусных векторов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-20046

НазваниеПерепрограммирование клеток жировой ткани с использованием аденоассоциированных вирусных векторов

Руководитель Егоров Александр Дмитриевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический Университет "СИРИУС" , Краснодарский край

Конкурс №66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова Борьба с ожирением, Побурение адипоцитов, Клеточное репрограммирование, Транскрипционная регуляция, Аденоассоциированные вирусы

Код ГРНТИ34.25.37

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности в развитых и развивающихся странах, в том числе в России. Метаболические нарушения, такие как ожирение и сахарный диабет 2-го типа, значительно увеличивают риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, что определяет интерес исследовательских групп к этой тематике. Ожирение диагностируется более чем у полумиллиарда людей и, являясь предвестником сахарного диабета 2-го типа, напрямую влияет на преждевременную смертность в этой группе. По данным Федерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи, Краснодарский край – один из регионов с наибольшей долей жителей с ожирением (27%), наряду с Калужской (33% жителей), Московской (30%) и Нижегородской (28%) областями, а также Алтайским краем (27%). Кроме того, согласно последним статистическим данным, в Краснодарском крае зарегистрировано наибольшее количество случаев ожирения у детей и подростков в возрасте от 0 до 15 лет (14637). Развитие жировой ткани происходит как в ходе эмбрионального развития, так и на протяжении всей жизни организма. При этом, в процессе адипогенеза из мезенхимальных стволовых клеток образуются адипоциты. Морфологически и функционально различают белый и бурый типы жировой ткани. Основную массу этих двух типов жировой ткани составляют, соответственно, клетки: белые и бурые адипоциты. Бурая жировая ткань в организме взрослого человека представлена мало и сосредоточена в подмышечных впадинах, межлопаточной и надключичной областях. В бурых адипоцитах экспрессируется ген термогенина UCP1, белка разобщающего дыхательную цепь в митохондриях, что позволяет транспортируемым протонам входить в матрикс без синтеза АТФ. Это приводит к высвобождению энергии в форме тепла, а поскольку вместе с протоном UCP1 переносит свободные жирные кислоты, использующиеся в качестве субстрата для окисления в бурой жировой ткани, то и к ускорению катаболического обмена. Показано, что среди людей с бурой жировой тканью меньше распространены кардиометаболические заболевания. Наличие бурой жировой ткани коррелирует с более низким уровнем диабета 2-го типа, дислипидемии, ишемической болезни сердца, гипертонии. Хорошо описаны транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов: к ним относятся PGC1α (коактиватор основного фактора транскрипции адипогенеза PPARγ), N-метилтрансфераза лизинов гистонов PRDM16 и совсем недавно охарактеризованный фактор FoxP4. Активация программы бурового адипогенеза в белой жировой ткани приводит к появлению скоплений «бежевых» адипоцитов, в которых происходит интенсивный липолиз и термогенез. Терминальная дифференцировка клеток белой жировой ткани была предметом наших предыдущих исследований. Были получены результаты, описывающие не исследованные ранее аспекты адипогенеза, такие как вовлеченность транскрипционных факторов TALE в раннюю активацию генов дифференцировки адипоцитов, а также чувствительность клеток-предшественников к гормонам. В данном проекте предполагается использовать генетические конструкции, кодирующие транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4, для активации транскрипционной программы бурой жировой ткани, трансдиффенцировки белого в бежевый жир. Доставка генов, кодирующих регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов, будет осуществляться при помощи аденоассоциированных вирусных векторов 8 и 9 серотипов, которые демонстрируют высокую специфичность по отношению к клеткам жировой ткани. Кроме того, для ограничения неспецифических эффектов мы планируем использовать тканеспецифичные промоторы для ограничения экспрессии трансгенов, а также возможно регулировать активность с помощью оптогенетического модуля. На первом этапе планируется создание генетических конструкций для последующей сборки в аденоассоциированные вирусные частицы. Последующее тестирование плазмид, кодирующих транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 будет проводиться на линии преадипоцитов мыши 3T3-L1. Клетки этой линии способны к спонтанной дифференцировке, а при экспрессии генов транскрипционных факторов мы рассчитываем регистрировать экспрессию термогенина (UCP1). На предварительно дифференцированных клетках линии 3T3-L1 возможно протестировать генетические конструкции, кодирующие транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 под контролем тканеспецифичных промоторов. После проверки способности генетических конструкций, кодирующих транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 под контролем тканеспецифичных промоторов, к стимуляции экспрессии UCP1 планируется продукция аденоассоциированных вирусных векторов 8 и 9 серотипов. Для оценки трансдуцирующей способности аденоассоциированных вирусных векторов и стимуляции экспрессии UCP1 планируется использовать как клетки линии 3T3-L1, так и животных (мыши линии C57/Bl6 на нормальной и высокожировой диете). В распоряжении научного коллектива есть всё необходимое оборудование, включая тепловизор FLIR T840, который позволяет регистрировать тепловое излучение.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Егоров А.Д. Аденоассоциированные вирусные векторы для доставки генов в клетки жировой ткани Синтетическая биология и биофармацевтика. Материалы всероссийской конференции, стр. 85, Новосибирск, 2022, Издательство: ООО «Офсет-ТМ» (год публикации - 2022)

2. Егорова В.С., Гурциева Д.Т., Егоров А.Д. Влияние пищевых молекул на переход белой жировой ткани в бежевую Ожирение и метаболизм, Ожирение и метаболизм. 2024;21(3):295-301. (год публикации - 2023)
10.14341/omet13070

3. Бойченко С.С., Юнин М.А., Егоров А.Д. Аденоассоциированные вирусные векторы для перепрограммирования жировых клеток Гены и клетки, Том XVIII, Приложение, стр. 8 (год публикации - 2023)

4. Бойченко С.С., Гасанов Н.Б., Егоров А.Д. Assessment of 3T3-L1 transduction using different AAV capsid variants 9th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, S5. Natural Products and Biopharmaceuticals (год публикации - 2023)
10.3390/ECMC2023-15628

5. Минская Е.С, Галиева А.А., Егоров А.Д., Иванов Р.А., Карабельский А.В. Viral vectors in gene replacement therapy Biochemistry (Moscow) (год публикации - 2023)

6. Малоголовкин А.С., Егоров А.Д., Карабельский А.В., Иванов Р.А., Верхуша В.В. Optogenetic technologies in translational cancer research Biotechnology Advances, Volume 60, November 2022, 108005 (год публикации - 2022)
10.1016/j.biotechadv.2022.108005

7. Бойченко Станислав, Абдуллина Алина, Лактюшкин Виктор, Бровин Андрей, Егоров Александр Assessment of Adipocyte Transduction Using Different AAV Capsid Variants Pharmaceuticals, Pharmaceuticals 2024, 17(9), 1227 (год публикации - 2024)
10.3390/ph17091227

8. Юнин Максим, Бойченко Станислав, Лебедев Петр, Дейкин Алексей, Покровский Михаил, Егоров Александр Gene Therapy Approach for Treatment of Obese Agouti Mice International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2024, 25(22), 12144 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252212144

9. Бойченко Станислав, Егорова Вера, Бровин Андрей, Егоров Александр White-to-Beige and Back: Adipocyte Conversion and Transcriptional Reprogramming Pharmaceuticals, Pharmaceuticals 2024, 17(6), 790 (год публикации - 2024)
10.3390/ph17060790

10. Егоров А.Д., Бойченко С.С. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность гена PRDM16, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ его доставки и способ снижения массы тела млекопитающего Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности «Изобретения. Полезные модели», Бюллетень «Изобретения. Полезные модели», № 4–2025, 28.01.2025-10.02.2025, Патенты на изобретения, 2834035 (год публикации - 2025)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. а) Была продемонстрирована возможность оптической стимуляции факторов транскрипции с использованием бактериохромных светочувствительных модулей iLight. Относительный уровень экспрессии гена Ucp1 в образцах FOXP4-iLight и PRDM16-iLight-CMV после оптической стимуляции уровень транскриптов Ucp1 был ниже pAAV-CMV-FOXP4 и pAAV-CMV-PRDM16. Также продемонстрирована возможность снижения эффектов активации экспрессии гена Ucp1 при использовании данного подхода. б) Были созданы плазмидные вектоpы, кодирующие тканеспецифичные промоторы AdipoQ, FABP4, UCP1. В результате экспериментального тестирования был определён промотор из тестируемых, обеспечивавший относительно высокую экспрессию в клеточной системе 3T3-L1 тканеспецифичный промотор aP2 (FABP4). Детектировали различия в специфичности промоторов UCP1 и AdipoQ: первый был более активен в дифференцирующихся клетках, тогда как второй в уже дифференцированных адипоцитах. 2. Созданы 24 транскриптомные библиотеки, которые проанализированы с использованием автоматизированной системы капиллярного электрофореза Agilent TapeStation. Образцы готовы к сеrвенированию на платформе Illumina NovaSeq 6000. 3. Исследование эффективности доставки генов транскрипционных регуляторов PRDM16 и FoxP4 с использованием аденоассоциированных вирусных векторов в клетки белой жировой ткани in vivo проводили на мышах линии C57/Bl6 на высокожировой диете, а также мышах С57ВL/6-АY. В эксперименте с мышами линии C57/Bl6 на высокожировой диете было продемонстрировано, что введение векторов AAV8-PRDM16 и AAV8-FOXP4 приводит к увеличению экспрессии трансгенов в жировой ткани. В эксперименте с самками мышей генотипа Agouti линии C57/Bl6 введение вирусных векторов AAV8-FoxP4, AAV8-PRDM16 и AAV9-Fst344 приводило к снижению веса на 10–14% в течение первых 3 недель, после 1 месяца мыши из всех групп показали заметное увеличение набора веса. Индуцированный перевозкой животных стресс привел к серьезному снижению массы тела, мыши из всех групп показали схожую потерю веса до 40% от их веса до транспортировки. В эксперименте с самцами мышей генотипа Agouti линии C57/Bl6 при введении вирусных векторов AAV8-FoxP4, AAV8-PRDM16 и AAV8-UCP1 сравнение опытных групп с контрольной отдельно по каждым суткам показало значимое снижение дыхательного коэффициента в группе с введением препарата AAV8-FoxP4 на значительных промежутках времени, что может косвенно свидетельствовать о переходе на использование в качестве источника энергии жиров. После индукции стресса (перевозка на площадку Университета "Сириус", пересадка в другой тип клеток) наблюдалось снижение массы тела в группе AAV8-FoxP4. Данные свидетельствуют о зависимости эффективности применения кодирующих FoxP4 аденоассоциированных вирусных векторов от пола экспериментальных животных, а также о влиянии окружающей среды, в том числе стресса при перевозке, на снижение массы тела. 4. Нецелевое метаболомное профилирование проводилось с помощью газовой хроматографии – масс-спектрометрии на газовом хроматографе Кристалл 5000 (Хроматэк, Россия) с одноквадрупольным масс-спектрометрическим детектором с использованием ионизации методом электронного удара. Аннотацию пиков, расчет площадей и времен удерживания проводили в программе Хроматэк Аналитик 3.1 (Хроматэк, Россия). Идентификация соединений проводилась путем сопоставления полученных масс-спектров со спектрами соединений в базе NIST20. Для поиска метаболитов статистически значимо различающихся между группами (p<0.05) проводили попарное сравнение контрольной группы с экспериментальной c использованием t-критерия. В исследованиях in vitro проведена оценка изменения метаболомного профиля дифференцированных клеток 3T3-L1 при их трансдукции аденоассоциированными вирусами, которые кодируют гены FOXP4, PRDM16 или UCP1. Для получения дополнительной информации о метаболомном профиле трансдуцированных клеток было проведено нецелевое профилирование с использованием газовой хроматографии – масс-спектрометрии. В результате проведенных исследований нами выявлено статистически значимое снижение уровней нескольких новых метаболитов в экспериментальных образцах по сравнению с контролем: лактата, миристиновой кислоты, метилового эфира линолевой кислоты, метилового эфира 10-октадеценовой кислоты. 5. Исследование липидных метаболитов в жировой ткани мышей, получавших AAV8-FoxP4, AAV8-PRDM16 и AAV9-Fst344, по сравнению с контролем (пустой AAV) продемонстрировало наличие значимо измененных веществ между двумя группами. Из 168 обнаруженных липидов 85 липидов показали значительные различия в их распространенности, когда мыши получали AAV9-FST, и сравнивались с контрольными группами. Для AAV8-FoxP4 50 липидов и для AAV8-PRDM16 68 липидов были значительно изменены по сравнению с контролем. В результате нецелевого профилирования метаболитов экспериментальных групп по сравнению с контрольными животными. Обнаружено, что введение мышам AAV-FOXP4, приводит к снижению содержания в сыворотке крови 3-гидроксимасляной и вакценовой кислот по сравнению с контрольной группой. При введении мышам аденоассоциированных вирусов, кодирующих гены FOXP4, PRDM16 или UCP1 в жировой ткани обнаружено повышение содержания некоторых метиловых эфиров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (метилпальмитат, глицерол моноолеат, 1-монолинолеин, метил октадеканоат, метиловый эфир линолевой кислоты, метиловый эфир 10-октадеценовой кислоты).. При введении мышам AAV-UCP1 также выявлено статистически значимое снижение уровней холестерола, 5-оксопролина и глицерола по сравнению с контрольной группой. Данные, полученные в отчетном периоде работ по проекту были представлены в рамках научно-образовательной лекции «Жир — проблема или суперсила? Почему белый жир может убить, а бежевый — спасти жизнь?» на дне Федеральной территории Сириус Международной выставки-форума «Россия»: https://sirius.gov.ru/tpost/nz9hn2v1r1-na-vistavke-rossiya-proidet-den-federaln Устное выступление с докладом "Перепрограммирование клеток жировой ткани" на Международном Конгрессе “VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 300-летию российской науки и высшей школы” в гор. Саратов 14-19 июня 2024 года; Приглашённый доклад "Загрязняющие окружающую среду вещества и метаболические нарушения" (Environmental pollutants and metabolic diseases) на Международной конференции по природоохранным разработкам и технологиям в гор. Денпасар, Индонезия 29-30 августа 2024 года; Приглашённый доклад "Перепрограммирование клеток белой жировой ткани: новые аспекты" на Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Флуоресценция для биомедицины» в гор. Нижний Новгород 8-11 сентября 2024 года; Три устных доклада аспирантов на Всероссийской научной конференции «Биохимия человека 2024» в гор. Москва 17-19 октября 2024 года.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Использование технологии создания рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов позволяет создать прототипы новых лекарственных препаратов для терапии наследственно обусловленных заболеваний. В ходе проекта сформирован научный и технологический задел, обеспечивающий создание прототипов новых лекарственных препаратов для терапии метаболических нарушений (сахарный диабет 2 типа, ожирение, неалкогольная жировая болезнь печени).