Создание гетерологической системы помп МЛУ для исследования бактериальной резистентности патогенных грамотрицательных бактерий

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00099

НазваниеСоздание гетерологической системы помп МЛУ для исследования бактериальной резистентности патогенных грамотрицательных бактерий

Руководитель Назаров Павел Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые слова бактерия, резистентность, помпа МЛУ, последовательность, тест-система, TolC,синтетические молекулы, разобщители окислительного фосфорилирования, антибиотики, протонофоры, локус, выравнивание последовательностей

Код ГРНТИ76.03.43

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В настоящее время устойчивость к противомикробным препаратам угрожает самим основам современной медицины и имеет последствия для всех областей здравоохранения. Сейчас отсутствуют новые подходы для лечения заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. Особенно ситуация осложнилась во время пандемии коронавирусной инфекции COVID-19, когда к вирусной инфекции присоединяется бактериальная инфекция, особенно если это мультиризистентные клинические штаммы. Недавнее обнаружение резистентности к антибиотику "последней надежды" колистину и смерть пациентки в США от штамма грамотрицательной «супербактерии» Klebsiella pneumoniae, устойчивой ко всем 26 антибиотикам, разрешенным в США, вызывает очень серьезную обеспокоенность как в российском медицинском сообществе, так и в международном. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) признала резистентность к антибиотикам кризисом современной медицины. Резистентность к антибиотикам объясняется не только генетическими мутациями в мишенях, на которые действуют антибиотики, или в ферментах, вызывающих их ускоренную деградацию, но и в работе помп множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Эффективная работа помп МЛУ бактерий способна на 2 порядка (в 50-100 раз) повышать минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) антибиотиков, что негативно сказывается на стоимости лечения, на токсичности для пациентов и прогнозе выживания для пациентов в случае генерализованной инфекции смешанной этиологии, особенно для людей старшего возраста или лиц с компрометированной иммунной системой (онкобольные, ВИЧ-инфицированные, некоторые орфанные заболевания). Современные подходы к анализу возбудителя бактериальной инфекции предполагает осуществление микробиологических посевов на различные среды с антибиотиками для выяснения чувствительности конкретного штамма, однако эти исследования занимают несколько дней и зависят от возможности качественного отбора проб. Альтернативным подходом является метод анализа последовательности помп МЛУ, предложенный нами, который позволяет за несколько часов найти антибиотик, эффективно преодолевающий бактериальную защиту, обусловленную работой помп МЛУ, и дающий 50-100 кратное снижение МИК для предложенного препарата. Нами была создана молекулярная тест-система на основе аминокислотных последовательностей белков AcrA, AcrB и TolC для поиска антибиотических лекарственных препаратов, которая позволяет по анализу последовательности предсказывать антибиотик, преодолевающий защиту основных 8 помп МЛУ грамотрицательных бактерий. В данном проекте мы хотели связать полученную ранее тест-систему с клинической практикой, а именно создать быстрый эффективный протокол для анализа последовательностей помп МЛУ, и валидировать использование полученной гетерологической системы помп МЛУ на патогенных грамотрицательных бактериях. Это позволит нам создать метод, позволяющий за несколько часов определить антибиотик, эффективно преодолевающий бактериальную защиту, обеспечиваемую работой помп МЛУ, и в кратчайшие сроки предложить его в клиническую практику, в том числе для лечения осложнений коронавирусной инфекции, вызванных бактериями. Этот подход также даст возможность исследовать резистентность высокопатогенных бактерий (например I и II группы патогенности) в обычных лабораторных условиях.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Назаров П.А., Кузнецова А.М., Каракозова М.В. Помпы множественной лекарственной устойчивости как краеугольный камень резистентности бактерий Вестник Московского Университета, Серия 16 Биология, Т. 77, № 4,C. 215–223 (год публикации - 2022)
10.55959/MSU0137-0952-16-2022-77-4-215-223

2. Павлова Ю.А., Терещенков А.Г., Назаров П.А., Лукьянов Д.А., Скворцов Д.А., Польшаков В.И., Васильева Б.Ф., Ефременкова О.В., Каюмов М.Ю., Палескава А., Коневега А.Л., Донцова О.А., Остерман И.А., Богданов А.А., Сумбатян Н.В. Conjugates of Chloramphenicol Amine and Berberine as Antimicrobial Agents Antibiotics, номер 12, том 1, 15 (год публикации - 2023)
10.3390/antibiotics12010015

3. Назаров П.А., Хрульнова С.А., Кессених А.Г., Новоятлова У.С., Кузнецова С.Б., Баженов С.В., Сорочкина А.И., Каракозова М.В., Манухов И.В. Observation of Cytotoxicity of Phosphonium Derivatives Is Explained: Metabolism Inhibition and Adhesion Alteration Antibiotics, номер 12, том 6, 720 (год публикации - 2023)
10.3390/antibiotics12040720

4. Назаров П.А., Майоров К.Б., Апт А.С., Скулачев М.В. Penetration of Triphenylphosphonium Derivatives through the Cell Envelope of Bacteria of Mycobacteriales Order Pharmaceuticals, номер 16, том 5, 668 (год публикации - 2023)
10.3390/ph16050688

5. Эшбоев Ф, Каракозова М, Абдурахманов Ж, Бобакулов К, Долимов К, Абдурашидов А, Баймирзаев А, Махнев А, Терентьева Е, Сасмаков С, Пиякина Г, Эгамбердиева Д, Назаров П.А., Азимова С. Antimicrobial and Cytotoxic Activities of the Secondary Metabolites of Endophytic Fungi Isolated from the Medicinal Plant Hyssopus officinalis Antibiotics, номер 12, том 7, 1201 (год публикации - 2023)
10.3390/antibiotics12071201

6. Назаров П.А., Каракозова М.В. New Approaches to the Production of Antibiotics: Antibiotics of Plant and Endophytic Origin and the Role of Multidrug Resistance Pumps Plants and Microorganisms: Biotechnology of the Future (год публикации - 2025)

7. Назаров П.А., Зиновкина Л.А., Брезгунова А.А., Лямзаев К.Г., Головин А.В., Каракозова М.В., Котова Е.А., Плотников Е.Ю., Зиновкин Р.А., Скулачев М.В., Антоненко Ю.Н. Relationship of Cytotoxic and Antimicrobial Effects of Triphenylphosphonium Conjugates with Various Quinone Derivatives Biochemistry (Moscow), выпуск 89, номер 2, стр. 212-222 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924020032

8. Назаров П.А., Зиновкина Л.А., Брезгунова А.А., Лямзаев К.Г., Головин А.В., Каракозова М.В., Котова Е.А., Плотников Е.Ю., Зиновкин Р.А., Скулачев М.В., Антоненко Ю.Н. Соотношение цитотоксического и антимикробного действия коньюгатов трифенилфосфония с различными производными хинона БИОХИМИЯ, том 89, вып. 2, с. 228–240 (год публикации - 2024)
10.31857/S0320972524020033

9. Кирсанов Р.С., Хайлова Л.С., Краснов В.С., Фирсов А.М., Лямзаев К Г., Пантелеева А.А., Попова Л.Б., Назаров П.А., Ташлицкий В.Н., Коршунова Г.А., Котова Е.А., Антоненко Ю.Н. Spontaneous reversal of small molecule-induced mitochondrial uncoupling: the case of anilinothiophenes FEBS Journal, статья 173129, стр. 1-17 (год публикации - 2024)
10.1111/febs.17329

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
За прошедший год нами были написаны и опубликованы 2 исследовательские статьи, 1 обзорная статья (в печати), а также 3 исследовательские статьи готовятся к отправке в журналы. Кроме того, мы полностью выполнили экспериментальную работу по проекту согласно плану на 2024 год и сделали дополнительные исследования по тематике проекта. Из научных результатов мы бы хотели отметить обнаружение принципиально нового механизма действия SkQ1. Долгое время считалось, что механизм действия основан на снижении мембранного потенциала за счет протонофороподобного действия SkQ1 и жирных кислот. Однако, это входило в противоречие с данными на классических разобщителях, например CCCP, которые так же снижали потенциал, при этом мог не наблюдаться бактерицидный эффект на бактериях. Поиск альтернативных механизмов действия занимает уже более 15 лет во всем мире и было показано, что других механизмов не известно. SkQ1 не влиял на синтез белка рибосомами и не влиял на синтез нуклеиновых кислот. Более того, было показано, что предполагаемое исходя из структуры детергентное действие не наблюдается при минимально ингибирующих концентрациях. Обнаружение нами данные по механизму действия и соотношение теоретически рассчитанных концентраций с экспериментом показало, что, по-видимому, это и является тем самым механизмом действия, которое определяет летальность для бактерий действия SkQ1. Другим замечательным результатом является подтверждение того, что небольшие изменения в структуре хинонов не влияют на распознавание их помпами МЛУ. Наши данные подтверждают нашу гипотезу, что в ходе эволюции помпы бактерий научились не распознавать хиноны и не совершать бессмысленную работу по их откачке из клеток. При сильном изменении, как это происходит в случае SkQB, вещество сразу становится видимым и множество помп берутся за его откачку, поэтому удаление отдельных помп, по-видимому, не приводит к заметному эффекту. Кроме того, резкультаты молекулярного докинга показывают и объясняют, как перемещается молекула SkQ1 внутри белка TolC в зависимости от его конформации (закрытой и открытой) и можно предположить механизм его работы на основе производных SkQ. Более того, было показано, что в отличие от классических антибиотиков, активность SkQ1 зависит от соотношения клеток и действующего вещества. Так же был показан защитный эффект мертвых клеток и накопление SkQ1 внутри клеток по принципу «пылесоса» из всего инкубационного объема. Нами был предложен обновленный механизм действия SkQ1 на клетки эукариот и прокариот. Мы проанализировали антибактериальные препараты для ветеринарии: энронит (энрофлоксацина с колистином), тилозин, нитокс (окситетрациклин), дитрим (сульфадимезин и триметоприм), флорокс (флорфеникол), лексофлон (лефлофлоксоцин) и др. Для всех построили диаграммы, показывающие участие TolC-содержащих помп. Важность этой работы заключается в том, что бесконтрольное использование антибиотиков в ветеринарии является фактором, негативно влияющим на распространение антибиотикорезистентности. Часто антибиотики в ветеринарии применяют без учета показаний к применению и это сказывается на общем фоне антибиотикорезистентности. Исследовано влияние препаратов на основе трифенилфосфония на различные фитопатогены как грамположительные, так и грамотрицательные. Было показано, что препараты способны бороться с патогенами, вызывающими увядание люцерны, увядание кукурузы, бактериальный рак томата, черную гниль крестоцветных, бактериальный ожог садовых подвоев, кольцевую гниль картофеля и др. Мы так же провели исследования влияния SkQ1 на всхожесть семян при обработке и выяснили, что SkQ1 значительно снижает обсемененность бактериями и грибами обработанных семян и делая их сравнимыми с коммерческими высококачественными семенами. Так же нами было показано, что для большого числа разных видов растений протравление SkQ1 увеличивает процент всхожести семян. Так же мы синтезировали соединения анилинотиофены, которые в определенных тканях вызывают кратковременное митохондриальное разобщение. Это процесс, при котором в митохондриях уменьшается накопление АТФ и увеличивается образование тепла. Соединения можно использовать как прототипы действующих веществ лекарственных препаратов для локального повышения температуры в органах. Например, сжигать жир, но не во всем организме, а в проблемных местах. Было показано нами, что эти вещества обладают антибактериальной активностью, и не обладают цитотоксичностью, что делает их интересными препаратами. Заявленная в заявке задача создания тест-системы выполнена на уровне прототипа.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В ходе выполнения данного проекта нами были получены результаты, позволяющие на практике применить их в разработке как антибактериальных препаратов, так и для диагностики и применения в практической ветеринарии и сельском хозяйстве и семеноводстве и овощеводстве. Кроме того, нами была показана принципиальная возможность создания антитуберкулезных препаратов, что может быть использовано в фармацевтике и народном здравоохранении. Кроме того, разработанная нами тест-система как прототип может быть напрямую использована для разработки высокоэффективного диагностикума. Антибактериальные препараты могут быть использованы для лечения болезней растений, вызываемых фитопатогенами, протравления семян и предпосадочной обработки клубней. Данные полученные по антибактериальным препаратам ветеринарного применения могут быть использованы для более вхвещенного подхода к применению антибиотиков, что снизит нагрузку как на сельское хозяйство так и на природные экосистемы.