Роль протеинкиназ CDK8/19 в организме: регуляция эмбриогенеза, ответов на стресс и поведения опухолей

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00227

НазваниеРоль протеинкиназ CDK8/19 в организме: регуляция эмбриогенеза, ответов на стресс и поведения опухолей

Руководитель Штиль Александр Альбертович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые слова циклинзависимые протеинкиназы 8 и 19, Медиатор, ингибиторы cdk8/19, эмбриогенез, канцерогенез, трансгенные мыши.

Код ГРНТИ76.03.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Циклинзависимая киназа 8 и ее паралог 19 (CDK8/19) относятся к классу циклинзависимых киназ, не участвующих в контроле смены фаз клеточного цикла, а регулирующих транскрипцию генов. В комплексе с циклином С, белками MED12 и MED13 CDK8/19 формируют киназный модуль транскрипционного комплекса Mediator, опосредующего активацию транскрипции. Детали молекулярных событий, посредством которых CDK8 и -19 осуществляют транскрипционный контроль, исследованы недостаточно. Особая биологическая роль CDK8/19 состоит в перепрограммировании транскрипции - “перестроении” этого механизма для адаптивного приспособления транскрипционного профиля клетки к изменению внешних условий. Перепрограммированию подвергаются активно транскрибируемые гены: в эмбриональном развитии, быстром ответе на стрессовые раздражители, в опухолевых клетках. Следовательно, в онтогенезе роль CDK8/19 неоднозначна: указанный механизм приобретает существенную важность в зародышевый период (функции жизненно важны) и при адаптации взрослого организма; среди патологических состояний перепрограммирование транскрипции значимо для отдельных аспектов биологии опухолей, главным образом, в становлении лекарственной устойчивости клеток - процессу, сопровождающемуся адаптацией к стрессу. Таким образом, функции CDK8/19 отличаются спецификой: этот механизм работает в клетках конкретного тканевого происхождения и в контексте отдельных транскрипционных факторов в ответ на индивидуальный сигнал. Перепрограммирование транскрипции - специализированный механизм регуляции отдельных генов и фенотипов. Настоящий проект направлен на установление молекулярных механизмов, регулируемых CDK8/19 в физиологических и патологических процессах: нормальном эмбриогенезе, ответах на стрессовые воздействия и в поведении опухолевых клеток. В большинстве исследований перепрограммирования транскрипции используются фармакологические ингибиторы CDK8/19. С их помощью установлены важные функции указанных киназ. Ингибиторы CDK8/19 проходят клинические испытания как противоопухолевые препараты. Отдельные линии и нативные клетки острого миелоидного лейкоза высоко чувствительны к ингибиторам CDK81/9. Установлена возможность замедлять становление чувствительности клеток рака молочной железы к таргентным препаратам в комбинациях с ингибиторами CDK8/19. Однако применение этих соединений недостаточно для суждения о роли перепрограммирования транскрипции: наряду с энзиматическими функциями CDK8/19 могут осуществлять киназо-независимые функции - как компоненты мультибелкового комплекса Mediator. В некоторых работах демонстрируются фенотипические различия фармакологического (ингибиторы киназной функции CDK8/19) и генетического (редактирование генов для инактивации этих белков) подходов к модуляции CDK8/19, однако существование опосредованных CDK8/19 некиназных механизмов регуляции остается под вопросом. Поэтому необходимо создание лабораторных моделей, позволяющих регулировать экспрессию генов CDK8 иCDK19 в организме в целом и в отдельных тканях. Кроме того, клетки человека и мыши могут проявлять различную чувствительность к ингибиторам CDK8/19, что затрудняет использование фармакологического подхода в животных моделях. Главная особенность и новизна исследовательской стратегии в настоящем проекте - уникальная коллекция трансгенных мышей с разнообразной регуляцией CDK8 и -19. Трансгенные мыши с конститутивным нокаутом гена Сdk8 нежизнеспособны: эмбрионы погибают на ранних стадиях развития. Трансгенные мыши с нокаутом гена Сdk19 были получены в рамках скринингового проекта в Jackson Laboratory (Bar Harbor, США). У этих животных не выявлено серьезных нарушений и патологических процессов. Кондиционный нокаут гена Сdk8 не влиял на жизнеспособность взрослых мышей. Однако, в этих экспериментах не учитывался паралог Cdk19, способный частично компенсировать инактивацию Cdk8. Кроме того, не было показано, что тамоксифен-зависимая Cre-рекомбиназа одинаково эффективно вырезает участок гена Cdk8 во всех тканях. В нашей лаборатории впервые получены мыши, гомозиготные по нокауту гена Сdk19, а также тройные трансгены с нокаутом Сdk19, условным нокаутом Сdk8 и тамоксифен-зависимым убиквитивным активатором, а также тамоксифен-независимым нейрональным активатором для специфического нокаута Сdk8 в мозге. Нами также получены трансгенные мыши, экспрессирующие (после введения тамоксифена) мутантную форму белка сdk8, лишенную киназной активности. После скрещивания этой линии с тройными трансгенами станет возможно переключать экспрессию CDK8 дикого типа на экспрессию мутантного варианта в организме и в отдельных тканях. Это позволит сделать выводы о том, какие из наблюдаемых явлений связаны с киназной функцией, а какие - с некиназной ролью CDK8. В рамках данной работы мы планируем выявить процессы, для которых CDK8/19 необходимы (эмбриогенез, нейрогенез, иммунный ответ), и определить молекулярные механизмы, опосредующие роль CDK8/19 в этих процессах. Кроме того, мы планируем оценить роль CDK8/19 в формировании и метастазировании сингенных опухолей и становлении лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Цель проекта: установить роль CDK8/19 в физиологических процессах и канцерогенезе на тканевом и организменном уровнях. Задачи: 1.Сравнить фенотип двойного нокаута Сdk8 и Cdk19 с фенотипом инактивации Cdk8: продолжительность жизни, анатомические и гистологические изменения. Эта задача будет выполняться в течение 1-2 гг. проекта. 2.Установить роль фармакологической и генетической инактивации Сdk8/19 в нормальном эмбриогенезе мыши. а) в жизнеспособности зигот, дифференцировке в бластулы и имплантации, б) в вынашивании беременности и постимплантационном развитии эмбрионов, в) в выживаемости и функции пре- и постнатальных нейронов коры больших полушарий головного мозга и фибробластов кожи. Эта задача будет выполняться в течение 1-2 гг. проекта. 3.Выявить значение Сdk8/19 в стрессовых ответах организма: активации генов цитокинов при действии провоспалительного стимулятора липополисахарида и выживаемости при ионизирующем облучении туловища. Эта задача будет выполняться в течение 2-го года проекта. 4.Выявить влияние нокаута Cdk8/19 в опухоли и ее микроокружении на образование, рост, метастазирование и становление лекарственной устойчивости сингенных опухолей. Эта задача будет выполняться в течение 3-го года проекта. Практический аспект проекта – поиск новых направлений применения ингибиторов CDK8/19 в терапии заболеваний человека (опухолей, инфекционных процессов и др.). Проект является развитием идей Мегагранта "Перепрограммирование транскрипции, опосредованное CDK8: биологические механизмы для медицины" (2018-2020, ведущий ученый I.Roninson, США). Этот проект позволил открыть Лабораторию молекулярной онкобиологии в учреждении-заявителе, исследовать механизмы перепрограммирования транскрипции в России и получить уникальные, не имеющие аналогов в мире, штаммы трансгенных мышей.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ильчук Л.А., Ставская Н.И., Варламова Е.А., Хамидуллина А.И., Татарский В.В., Могила В.А., Колбутова К.Б., Богдан С.А., Шереметов А.М., Баулин А.Н., Филатова И.А., Силаева Ю.Ю., Филатов М.А., Брутер А.В. Limitations of Tamoxifen Application for In Vivo Genome Editing Using Cre/ERT2 System International Journal of Molecular Sciences, 23(22), 14077 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232214077

2. Ставская Н. И., Ильчук Л. А., Окулова Ю. Д., Кубекина М. В., Варламова Е. А., Силаева Ю. Ю., Брутер А. В. ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КИНАЗА-НЕЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЦИКЛИН-ЗАВИСИМЫХ КИНАЗ CDK8/19 ВЕСТНИК РГМУ, №6, с. 43–47 (год публикации - 2023)
10.24075/vrgmu.2022.066

3. Ильчук Л. А., Кубекина М.В., Окулова Ю. Д., Силаева Ю. Ю., Татарский В.В., Филатов М.А., Брутер А. В. Genetically Engineered Mice Unveil In Vivo Roles of the Mediator Complex International Journal of Molecular Sciences, 24(11), 9330 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24119330

4. Ставская Н.И., Татарский В.В., Брутер А.В. ВЛИЯНИЕ ОДНОВРЕМЕННОГО НОКАУТА CDK8 И CDK19 НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ И ФЕРТИЛЬНОСТЬ МЫШЕЙ С57BL/6 Сборник тезисов XVIII Международной (XXVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (МОСКВА, 16 марта 2023 г.), с. 78-79 (год публикации - 2023)

5. Н.И. Ставская, Е.А. Варламова, М.В. Уткина, В.П. Богданов, З.Г. Антышева, В.В. Татарский, А.В. Брутер Нарушение сперматогенеза у самцов мышей С57BL/6 с одновременным нокаутом CDK8 и CDK19 Материалы 65-й Всероссийской научной конференции МФТИ в честь 115-летия Л.Д. Ландау (03 апреля - 08 апреля 2023 года), с.153-155 (год публикации - 2023)

6. Ильчук Л.А., Сафонова П.Д., Коршунов Е.Н., Силаева Ю.Ю., Филатов М.А. Подходы к редеривации ценных линий животных, инфицированных патогенными микроорганизмами Ветеринария, Зоотехния и Биотехнология, № 12, т. 2 С. 85–94. (год публикации - 2023)
10.36871/vet.zoo.bio.202312209

7. Брутер А.В., Варламова Е.А., Окулова Ю.Д., Татарский В.В., Силаева Ю.Ю., Филатов М.А. Genetically Modified Mice As A Tool For The Study Of Human Diseases Molecular Biology Reports, Volume 51, article number 135 (год публикации - 2023)
10.1007/s11033-023-09066-0

8. Кирюхина Т.А., Варламова Е.А. ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОГО ИНГИБИРОВАНИЯ И НОКАУТА ЦИКЛИНЗАВИСИМЫХ КИНАЗ 8/19 НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ МЫШИНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ Сборник тезисов XVIII Международной (XXVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (МОСКВА, 16 марта 2023 г.), стр.135-136 (год публикации - 2023)

9. Брутер А.В., Варламова Е.А., Ставская Н.И., Антышева З.Г., Творогова А.В., Коршунова Д.С., Хамидуллина А.И., Уткина М.В., Богданов В.П., Никифорова А.И., Альберт Е.А., Максимов Д.О., Ли Дж., Чен М., Штиль А.А., Ронинсон И.Б., Могила В.А., Силаева Ю.Ю., Татарский В.В. Knockout of cyclin dependent kinases 8 and 19 leads to depletion of cyclin C and suppresses spermatogenesis and male fertility in mice eLife (год публикации - 2024)
10.7554/eLife.96465.1

10. Е.А. Варламова, Т.А. Кирюхина, А.К. Исагулиева, А.И. Хамидуллина, М.Ю. Сорокина, Ю.Ю. Силаева, В.В. Татарский, А.В. Брутер РОЛЬ CDK8/19 В ОТВЕТЕ НА СТРЕСС НА МОДЕЛИ МЫШИНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ Молекулярная биология (год публикации - 2025)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На третьем году выполнения проекта нам удалось получить достаточные популяции мышей с генотипом Cdk19-/-Cdk8+/- и подробно исследовать развитие эмбрионов Cdk19-/-Cdk8-/-. Оказалось, что как и эмбрионы Cdk8-/-, такие эмбрионы успешно проходят преимплантационные стадии развития, имплантируются и развиваются без видимых аномалий до стадии E8.5 включительно. Зато потом у эмбрионов с обоими генотипами обнаруживаются одинаковые аномалии развития: замедленный поворот, незакрытие нервной трубки, аномалии формирования головного мозга, причем у эмбрионов с двойным нокаутом аномалии более тяжелые, и гибель наступает раньше, чем у эмбрионов 8KO. Примечательно, что описанные в литературе мыши с нокаутом циклина C (Li, 2014) – партнера, необходимого для активности CDK8/19, довольно точно повторяют обнаруженный нами фенотип, хотя в литературе существовали различные предположения о том, как будут вести себя эмбрионы с двойным нокаутом CDK8/19. Для объяснения нарушения формирования нервной системы у нокаутных эмбрионов мы получили ex vivo культуру клеток нервного гребня и оценили ее способность к миграции в присутствии ингибитора CDK81/19. Оказалось, что ингибирование замедляет миграцию в том числе и ex vivo. Ранее мы показали, что даже уже дифференцировавшиеся нейроны коры больших полушарий погибают от ингибирования/нокаута CDK8/19. Проведя секвенирование РНК таких образцов, мы пришли к выводу, что причиной их гибели является зависимость уровня экспрессии генов, кодирующих гликолитические ферменты от активности CDK8/19. Ранее зависимость между экспрессией этих генов и CDK8/19 статусом была показана только для некоторых опухолевых линий. Оказалось, что под действием Сенексина Б в нейронах меняется динамика ионов Ca2+. Так, в состоянии покоя цитоплазматическая концентрация Ca2+ увеличивается, зато в ответ на глутамат концентрация Ca2+ растет менее выраженно. Мы предполагаем, что наблюдаемый эффект может быть связан с нарушениями работы митохондрий. Выясняя, почему ингибитор CDK8/19 – сенексин Б – подавляет возобновление мейоза I в ооцитах, мы обнаружили, что у контрольных эмбрионов вскоре после активации начинает расти митохондриальный потенциал, в то время как у контрольных этого роста не происходит. Таким образом, мы считаем, что CDK8/19 задействованы в активации метаболизма, необходимого для созревания ооцитов. В прошлом году, изучая реакцию на облучение мышей дикого типа и мышей DKO мы обнаружили, что гибель последних наступает гораздо быстрее и при более низких дозах облучения. Сравнив, однако, поведение клеток разного типа и уровни повреждения ДНК, мы пришли к выводу, что причина более ранней гибели DKO – изначально худшее состояние кишечника, что затрудняет изучение молекулярных аспектов ответа на повреждение ДНК на данной модели. В связи с этим мы провели несколько экспериментов in vitro, в которых показали, что в ряде случаев CDK8/19 необходимы для репарации повреждений ДНК. Проведя первый долгосрочный эксперимент, мы обнаружили, что вес и уровень глюкозы в крови мышей DKO ниже, чем у остальных контрольных групп. Хотя это может быть связано с патологическим состоянием кишечника и нарушением всасывания у мышей DKO, существуют доказательства прямого влияния CDK8/19 на метаболизм. Нам удалось на молекулярном и клеточном уровне подтвердить влияние ингибирования и нокаута CDK8/19 на жировую дифференцировку адипоцитов. Окрашивание клеток и анализ экспрессии генов подтвердили, что мышиные эмбриональные фибробласты в отсутствие активности CDK8/19 проходят только ранние этапы дифференцировки. Вероятная причина этого – метаболические нарушения, вызванные отсутствием киназной активности CDK8/19. В пользу таких нарушений свидетельствует рост экспрессии генов, кодирующих гликолитические ферменты, и генов, кодируемых в митохондриальном геноме. Введение мышам дикого типа меланомы B16F10 дикого типа и с одновременным нокаутом CDK8/19 показало, что, хотя такие опухоли локально растут с одинаковой скоростью, нокаутные опухоли значительно уступают опухолям дикого типа в скорости метастазирования. Эти результаты хорошо согласуются с важной ролью WNT-сигналинга в метастазировании и нашими и литературными данными о ключевой роли CDK8/19 в регуляции WNT-сигналинга. Введение меланомы B16F10 мышам дикого типа и DKO дало, однако, более неожиданные результаты. Мы обнаружили, что в DKO мышах опухоли растут локально медленнее, что, возможно, может быть связано с более низким уровнем глюкозы у DKO мышей, но также может быть связано с усилением цитотоксических свойств иммунной системы, описанных для тканеспецифических нокаутов CDK8/19. Кроме этого, однако, мы обнаружили, что одна и та же опухоль формирует значительно больше метастазов в DKO мышах, чем в мышах дикого типа. При гистологическом исследовании мы обнаружили, что границы отдельных метастазов в DKO мышах имеют более диффузную форму. Причиной этого могут быть нарушения формирования межклеточного матрикса, указания на которые мы обнаружили при анализе результатов секвенирования РНК фибробластов, или нарушения WNT-сигналинга. В любом случае, эти данные предполагают, что нужна более аккуратная оценка эффектов ингибиторов CDK8/19 в качестве противоопухолевых средств с точки зрения влияния на метастазирование. Публикационные показатели соответствуют запланированным. В частности, по материалам исследований фертильности самцов и сперматогенеза была опубликована статья в высокоимпактном журнале eLife. 19 сентября прошла предзащита кандидатской диссертации исполнителя проекта Е.А. Варламовой “Циклин-зависимые киназы CDK8/19 как ключевые регуляторы стероидогенеза и фертильности у самцов мышей линии C57Bl/6”.

Публикации