Исследование клеточных механизмов развития патологий человека, ассоциированных с мутациями митохондриальной ДНК

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00317

НазваниеИсследование клеточных механизмов развития патологий человека, ассоциированных с мутациями митохондриальной ДНК

Руководитель Винокуров Андрей Юрьевич, Кандидат технических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева" , Орловская обл

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова цибриды, митохондриальная ДНК, мутации, биоэнергетика, ассоциированные с митохондриями заболевания

Код ГРНТИ34.19.27

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
На сегодняшний день известно свыше 400 заболеваний человека, происхождение которых связывают с дисфункцией митохондрий. Большинство из них на фенотипическом уровне проявляется в различных нейродегенеративных и нейромышечных симптомах, однако можно указать и другие группы расстройств. Среди наиболее распространённых патологий выделяют митохондриальную миопатию, синдром митохондриальной энцефаломиопатии, лактат-ацидоза и инсультоподобных эпизодов (MELAS), миоклоническую эпилепсию с рваными красными мышечными волокнами (MERRF), болезни Паркинсона и Альцгеймера, синдром Лея, наследственную глухоту, а также атеросклероз, сахарных диабет, кардиомиопатию и многие другие. Несмотря на сравнительно небольшой размер мтДНК, изучение закономерностей развития патологий, связанных с присутствующими в ней мутациями, представляет собой сложную научную задачу. Это объясняется: а) наличием в клетке большого количества митохондрий и обусловленным этим явлением гетероплазмии, в результате которого патологический фенотип проявляется только при превышении некоторого порогового значения доли мутантных форм мтДНК; б) постоянно протекающими процессами деления и слияния митохондрий, а также митофагии, в результате которых возможно изменение содержания в клетке мутантных форм мтДНК; в) прямым влиянием мутаций на функционирование самих митохондрий. Высокая плотность генов в мтДНК, а также преимущественная их связь с функционированием электронтранспортной цепи (ЭТЦ) (гены непосредственно компонентов ЭТЦ, а также рРНК и тРНК) дают основание предполагать о наличии существенного влияния мутаций мтДНК на обеспечение энергетических потребностей клеток. На сегодняшний день выполнено большое количество исследований нарушений в биоэнергетике клеток, ассоциированных с повреждениями мтДНК. Показано, что при определенном (различном для разных патологий) уровне гетероплазмии возможны изменения в содержании и скорости образования АТФ и АФК. Являясь в определенной степени интегральными для характеристики функционирования системы энергообеспечения клеток, данные показатели нуждаются в детализации. Поэтому научная новизна проекта будет заключаться в результатах комплексных исследований клеточных линий, несущих мутации в разных функциональных участках мтДНК с различными значениями гетероплазмии, включающие изучение широкого набора параметров состояния митохондрий (уровня и скорости образования АТФ, ММП, содержания и скорости превращения коферментов ЭТЦ, скорости образования АФК), митохондриальной динамики, а также связанных с функциональностью митохондрий процессов клеточной сигнализации. Это позволит выявить клеточные и молекулярные механизмы связи мутаций мтДНК и ассоциированных с ними патологий. В результате могут быть разработаны алгоритмы прогнозирования степени риска развития связанных с мутациями в мтДНК заболеваний на основе комплексной оценки параметров состояния митохондрий, а также корректировки состояния митохондрий как инструмента предотвращения или уменьшения последствий развития данных заболеваний. Возможность решения такой комплексной задачи определяется как планируемыми к исследованию объектами, так и совокупностью методологических подходов. В качестве основных объектов исследования будут выступать цибридные линии, каждая из которых характеризуется наличием от 7 до 10 мутаций генов мтДНК с различным уровнем гетероплазмии – от неспособного оказать значительного влияние на функционирование митохондрий до сопоставимого с пороговыми значениями, при которых происходит развитие ассоциированных с мутацией мтДНК патологий. Различия в распределении мутаций по цибридным линиям позволят установить характер зависимости между нарушениями мтДНК и соответствующими им отклонениями в функционировании митохондрий, для чего будут использоваться методы корреляционного анализа. Цибридные линии, которые будут предоставлены НИИ морфологии человека имени академика А.П. Авцына, были получены и успешно апробированы как модели для исследования клеточной патологии при развитии ряда заболеваний, ассоциированных с мутациями мтДНК. Применение таких моделей позволит выявить интересующие связи митохондриальной дисфункции и характера мутаций мтДНК без учета влияния особенностей различных типов клеток. Необходимые для изучения указанных параметров методы исследований в значительной степени отработаны, позволяя при анализе различных моделей получать достоверные количественные результаты с требуемым уровнем детализации – с возможностью оценки функционирования отдельных элементов ЭТЦ, химической природы АФК, источников синтеза АТФ в клетках, распределения и изменения содержания кальция в клеточных компартментах. Реализация проекта будет осуществляться на базе лаборатории клеточной физиологии и патологии, созданной в ФГБОУ ВО «ОГУ имени И.С. Тургенева» в рамках реализации гранта Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в российских образовательных организациях высшего образования, научных учреждениях и государственных научных центрах Российской Федерации № 075-15-2019-1877 от 03 декабря 2019 г. (в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 9 апреля 2010 г. № 220). Данная лаборатория оснащена всем необходимым оборудованием и обеспечивает проведение исследований на международном уровне, включая полный цикл работ с клеточными культурами. Необходимый уровень комплексной оценки состояния митохондрий и связанных с ними внутриклеточных процессов в исследуемых цибридных линиях будет обеспечен использованием гибкого методологического инструментария по одновременному изучению нескольких параметров в физиологических для клеток условиях, включающего флуоресцентную микроскопию, конфокальную микроскопию, в том числе высокого разрешения, полярографию, FRET-анализ. В результате в ходе выполнения проекта будет показана степень зависимости между нарушениями связанной с митохондриями биоэнергетики в цибридных линиях, несущих мутации в генах мтДНК с различной степенью гетероплазмии, а также происходящими при этом изменениями в системах митохондриальной кальциевой сигнализации и редокс-сигнализации, с одной стороны, и патогенезом заболеваний, ассоциированных с рассматриваемыми мутациями, с другой.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Орехов А.Н., Никифоров Н.Г., Омельченко А.В., Синёв В.В., Собенин И.А., Винокуров А.Ю., Орехова В.А. The Role of Mitochondrial Mutations in Chronification of Inflammation: Hypothesis and Overview of Own Data Life, Т. 12, №8, 1153 (год публикации - 2022)
10.3390/life12081153

2. Погонялова М.Ю., Кузнецова Е.А., Микенькина М.А., Винокуров А.Ю. Мутация митохондриально кодируемого гена NADH-дегидрогеназного комплекса оказывает влияние на митохондриальный мембранный потенциал Сборник научных трудов по материалам II международной научно-практической конференции «Клеточные технологии в экспериментальной медицине», С. 60-62 (год публикации - 2022)
10.21626/cb.22.cytology

3. Попов Д.Ю., Казаков М.С., Шитикова Е.Ю., Винокуров А.Ю. Оценка влияния мутаций митохондриальной днк на окислительно-восстановительный баланс клеток Сборник научных трудов по материалам II международной научно-практической конференции «Клеточные технологии в экспериментальной медицине», С. 53-55 (год публикации - 2022)
10.21626/cb.22.cytology

4. Попов Д.Ю., Казаков М.С., Шитикова Е.Ю., Винокуров А.Ю. Влияние мутаций митохондриальной днк на продукцию активных форм кислорода в матриксе и трансмембранном пространстве митохондрий Сборник тезисов IX международной конференции молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков, С. 631 (год публикации - 2022)

5. Кузнецова Е.А., Винокуров А.Ю. Морфология митохондриальной сети и базовые показатели митохондриального метаболизма в клетках с мутациями мтДНК Актуальная биотехнология, №1, С. 181-183 (год публикации - 2022)

6. Шитикова Е.Ю., Казаков М.С., Попов Д.Ю., Борисов Е.Е., Винокуров А.Ю. Степень сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях с мутациями мтДНК коррелирует с уровнем продукции АФК Сборник научных трудов Международной конференции «Наука и инновации», С. 170-172 (год публикации - 2022)

7. Попов Д.Ю., Погонялова М.Ю., Винокуров А.Ю. Changes in mitochondrial membrane potential levels in respiratory chain dysfunction caused by mtDNA mutations Biophysical Reviews, С.111-112 (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w

8. Казаков М.С., Шитикова Е.Ю., Винокуров А.Ю. The effect of mitochondrial DNA mutation complex on the content and production of ATP in cells Biophysical Reviews, С. 118. (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w

9. Винокуров А.Ю., Попов Д.Ю., Погонялова М.Ю., Шитикова Е.Ю., Казаков М.С., Кузнецова Е.А. Changes in metabolic parameters in cells with multiple mtDNA mutations associated with diseases Biophysical Reviews, С.73-74 (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w

10. Казаков М.С., Бережнов А.В., Федотова Е.И., Винокуров А.Ю. Корреляционный анализ влияния комбинаций мутаций митохондриальной ДНК на параметры состояния клеток Современные методы исследования в клеточной биологии и медицине: сборник трудов Всероссийской конференции, С.16 (год публикации - 2023)

11. Казаков М.С., Шитикова Е.Ю., Попов Д.Ю., Погонялова М.Ю., Кузнецова Е.А.,Винокуров А.Ю. Влияние комплекса мутаций митохондриальной ДНК на метаболизм в гликолитических клетках Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. Том 1., С.333-338 (год публикации - 2023)

12. Кузнецова Е.А., Безсонов Е.Е., Винокуров А.Ю. Оценка морфологии митохондриальной сети как метод изучения процессов митохондриальной динамики Современные методы исследования в клеточной биологии и медицине: сборник трудов Всероссийской конференции, С.18 (год публикации - 2023)

13. Шитикова Е.Ю., Казаков М.С., Попов Д.Ю., Борисов Е. Е. Мутации генов белков дыхательной цепи мтДНК влияют на сопряжение окислительного фосфорилирования в клетках Сборник тезисов XXXV зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", С.126 (год публикации - 2023)

14. Шитикова Е.Ю., Казаков М.С., Попов Д.Ю., Федотова Е.И., Бережнов А.В., Винокуров А.Ю. Влияние мутаций гена MT-CYTB на состояние клеток с нарушениями, развивающимися при атеросклерозе Материалы Международной конференции молодых ученых "Фундаментальная и прикладная медицина", С.77-80 (год публикации - 2023)

15. Попов Д.Ю., Казаков М.С., Шитикова Е.Ю., Винокуров А.Ю. Локализация мутаций митохондриальной ДНК влияет на характер изменения производства и нейтрализации активных форм кислорода митохондриями OpenBIO: сборник тезисов X международной конференции молодых ученых, С.289-390 (год публикации - 2023)
10.25205/978-5-4437-1526-1-205

16. Безсонов Е.Е., Байг М.С., Букринский М.И., Мясоедова В.А., Равани А.Л., Сухоруков В.Н., Чжан Д., Хотина В.А., Орехов А.Н. Editorial: Lipids and inflammation in health and disease, volume II Fronties in Cardiovascular Medicine, V. 10, P 1-4 (год публикации - 2023)
10.3389/fcvm.2023.1174902

17. Хотина В.А., Винокуров А.Ю., Багери Экта М., Сухоруков В.Н., Орехов А.Н. Creation of Mitochondrial Disease Models Using Mitochondrial DNA Editing Biomedicines, 11(2):532, P 1-28 (год публикации - 2023)
10.3390/биомедицина11020532

18. Погонялова М.Ю., Попов Д.Ю., Винокуров А.Ю. Мутации мтДНК снижают роль митохондрий в обеспечении кальциевого гомеостаза в клеточных моделях атеросклероза Труды XXIV Ежегодной молодежной конференции с международным участием ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика" (год публикации - 2024)

19. Погонялова М.Ю., Баженов П.А., Винокуров А.Ю. Влияние антиатерогенных мутаций мтДНК на кальциевый гомеостаз в клеточных моделях атеросклероза Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Тезисы докладов 16-й Международной научной конференции , C. 146-147 (год публикации - 2024)

20. "Винокуров А. Ю., Казаков М.С., Попов Д.Ю. , Шитикова Е.Ю. ,Погонялова М.Ю., Кузнецова Е.А., Баженов П.А. " Регуляция поляризации макрофагов как возможный механизм влияния мутаций митохондриальной ДНК на развитие атеросклероза Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем.Тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, C.180 (год публикации - 2024)

21. Винокуров А.Ю., Погонялова М.Ю. Андреева Л., Абрамов А.Ю., Ангелова П.Р. Energy substrate supplementation increases ATP levels and is protective to PD neurons Current Research in Pharmacology and Drug Discovery , Volume 6, 100187 (год публикации - 2024)
10.1016/j.crphar.2024.100187

22. Попов Д.Ю., Казаков М.С., Шитикова Е.Ю., Винокуров А.Ю. Связанные с атеросклерозоммутации мтДНК влияют на баланс между формами и локализацией продукции АФК в клетках Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Тезисы докладов 16-й Международной научной конференции , С. 148 (год публикации - 2024)

23. Шитикова Е.Ю., Коляева Е. Н., Казаков М.С., Винокуров А.Ю. ALTERATIONS IN mtROS AND REDUCED GLUTATHIONE PRODUCTION DON’T INFLUENCE VIABILITY OF ATHEOSCLEROSIS-ASSOCIATED CELLS Biophysical Reviews (год публикации - 2024)

24. Погонялова М.Ю. Влияние ассоциированных с атеросклерозом мутаций мтДНК на кальциевый гомеостаз в клетках Материалы XXXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» [Электронный ресурс] , С.1 (год публикации - 2024)

25. Баев А.Ю., Винокуров А.Ю., Потапова Е.В., Дунаев А.В., Ангелова П.Р.,Абрамов А.Ю. Mitochondrial Permeability Transition, Cell Death and Neurodegeneration Cells , 13(7), 648 (год публикации - 2024)
10.3390/cells13070648

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе заключительного этапа реализации проекта, направленного на выявление механизмов развития патологий, связанных с мутациями митохондриальной ДНК (мтДНК), был исследован комплекс параметров окислительно-восстановительного баланса и кальциевого гомеостаза в исследуемых клеточных линиях. Такое направление исследований связано с ключевой ролью митохондрий в данных процессах. Проведенные в соответствии с поставленными задачами исследования позволили выявить ряд зависимостей между повреждениями митохондриального генома и функцией митохондрий, а также процессов клеточного метаболизма и получить следующие научные результаты: - эксперименты с использованием селективно окисляющихся флуоресцентных зондов позволили выявить, что мутации мтДНК оказывают значительное влияние не только на скорость, но и локализацию продукции различных активных форм кислорода (АФК). Преобладание провоспалительных мутаций приводит к значительному увеличению утечки электронов в матрикс митохондрий, уровень которого снижается по мере роста гетероплазмии антивоспалительных мутаций. Аналогичные изменения в цитоплазме выявлены лишь для клеток с преимущественным повреждением генов тРНК и рРНК. При этом большинство клеточных линий характеризуется падением скорости образования перекиси водорода, свидетельствующим о снижении активности супероксиддисмутаз; - исследования уровня антиоксидантной защиты по содержанию восстановленного глутатиона, а также развития окислительного стресса по степени перекисного окисления липидов свидетельствуют об отсутствии в линиях с мутациями мтДНК серьезных окислительных повреждений, которые приводили бы к снижению жизнеспособности клеток. Однако это требует значительных затрат энергии, что в условиях дисфункции митохондрий усиливает зависимость клеток от гликолиза, которая характерна на провоспалительного метаболического профиля; - оценка стратегий регулирования окислительно-восстановительного баланса показывает, что в зависимости от сочетания мутаций мтДНК для клеточных линий характерны различные изменения как скорости образования АФК, так и уровня восстановленного глутатиона. При этом увеличение обеспеченности клеток субстратами, в том числе митохондриальными, представляется наименее эффективным способом коррекции их состояния; - для исследованных клеток характерны изменения механизмов поддержания кальциевого гомеостаза, связанные со снижением роли ионотропных пуринорецепторов, а также буферной емкости внутриклеточных кальциевых депо, прежде всего – эндоплазматического ретикулума и митохондрий; - выявленные методом корреляционного анализа связи между исследованными параметрами и мутациями мтДНК свидетельствуют о значительной зависимости регулируемых митохондриями процессов от уровня исследованных повреждений гена цитохрома b, который занимает центральную роль в транспорте электронов и связанных с ними процессах окислительного фосфорилирования. При этом параметры окислительно-восстановительного баланса и кальциевого гомеостаза в значительной степени коррелируют с показателями скорости пролиферации и жизнеспособности клеток. В ходе выполнения проекта в 2024 году опубликованы две статьи в журналах, рецензируемых в базе данных Scopus (Q1). Результаты выполнения проекта представлены на следующих конференциях и форумах: - XXXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (МГУ им. Ломоносова, Москва); - XIII Конгресса молодых ученых (ИТМО, Санкт-Петербург); - 6-й Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (БГУ, Минск); - XXIV Ежегодной молодежной конференции с международным участием ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (ИБХФ РАН, Москва); - Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Современные методы биофизических исследований живых и модельных биологических систем» (КазНЦ РАН, Казань); - IX Всероссийского молодежного научного форума «Наука будущего - наука молодых» (Самарский университет, Самара). Информация о данном проекте опубликованы на сайте ОГУ имени И.С. Тургенева, научно-технологического центра биомедицинской фотоники ОГУ имени И.С. Тургенева, а также в соответствующих аккаунтах: http://www.oreluniver.ru: http://www.bmecenter.ru; https://www.instagram.com/biomedical_photonics; https://www.youtube.com/user/BmeCenterOrel. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет, освящающие работы по проекту: 1. ученые НТЦ биомедицинской фотоники совместно с зарубежными коллегами опубликовали новое исследование (https://oreluniver.ru/media/news/show/1/21824); 2. участие в XIII Конгрессе молодых ученых (https://bmecenter.ru/ru/node/829); 3. международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (https://vk.com/bmecenter?w=wall-15522222_3299); 4. представление результатов исследований НТЦ биомедицинской фотоники в Минске (https://bmecenter.ru/ru/node/845); 5. доклад на тему «Атерогенные мутации митохондриальной ДНК ведут к формированию противовоспалительного фенотипа, участвующих в патологии клеток» на IX Всероссийском молодежном научном форуме «Наука будущего - наука молодых» (https://vk.com/bmecenter?w=wall-15522222_3424); 6. участие во Всероссийской школе-конференции молодых ученых Казанского научного центра РАН (https://oreluniver.ru/media/news/show/1/23571); 7. XXIV Ежегодная молодежная конференция c международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (https://vk.com/bmecenter?w=wall-15522222_3453).

Публикации