Поиск и конструирование новых бактериолитических ферментов бактериофагов с терапевтическими свойствами, действующими на антибиотико-резистентные Enterococcus и Bacillus.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00385

НазваниеПоиск и конструирование новых бактериолитических ферментов бактериофагов с терапевтическими свойствами, действующими на антибиотико-резистентные Enterococcus и Bacillus.

Руководитель Шадрин Андрей Михайлович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» , Московская обл

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова Устойчивость к антибиотикам, множественная антибиотикоустойчивость, ESKAPE, бактериальная инфекция, эндолизины, деполимеразы, хвостовые шипики, бактериофаги, бактериолитические ферменты, новые противомикробные препараты, Enterococcus faecalis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus

Код ГРНТИ34.27.59

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
С начала 2010x годов всё больше внимания акцентируется на проблемах увеличения частоты встречаемости антибиотикорезистентных микроорганизмов и на редкости появления новых антибактериальных веществ. Количество смертельных случаев, вызванных инфекциями антибиотико-резистентных бактерий, по данным за 2014 год в США оценивалось ~23 тыс., а в Евросоюзе – около 25 тыс. за год. Суммируя обе проблемы, в начале 2010-х годов был сделан прогноз, что к 2050 году «мир может вскоре погрузиться в темные века медицины», если не будут предприняты действия по борьбе с растущей угрозой устойчивости к антибиотикам. В 2020 году количество смертельных случаев, вызванных антибиотико-резистентными бактериями, значительно возросло по причине пандемии COVID-19 и ассоциированных с этим случаями вторичных бактериальных пневмоний, среди грамм-положительных бактерий доминирующими возбудителями которых были энтерококки и стафилококки. Одним из решений поиска новых антибактериальных агентов являются бактериофаги и их бактериолитические ферменты. Эндолизины, а также другие бактериолитические ферменты фагов являются одним из перспективных направлений поиска новых противобактериальных средств. Препарат «exebacase» компании ContraFect, на основе эндолизина, с 2020г успешно проходит третью фазу клинических испытаний. Данный проект направлен на поиск и конструирование новых бактериолитических ферментов бактериофагов с терапевтическими свойствами, действующими на антибиотико-резистентные штаммы Enterococcus и Bacillus.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Казанцева О.А., Пилигримова Э.Г., Шадрин А.М. Novel Bacillus-Infecting Bacteriophage B13—The Founding Member of the Proposed New Genus Bunatrivirus Viruses, 2022, 14, 2300. (год публикации - 2022)
10.3390/v14102300

2. Анна В. Скорынина, Ольга Н. Копосова, Олеся А. Казанцева, Эмма Г. Пилигримова, Наталья А. Рябова и Андрей М. Шадрин Isolation and Characterization of Two Novel Siphoviruses Novomoskovsk and Bolokhovo, Encoding Polysaccharide Depolymerases Active Against Bacillus pumilus International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(21), 12988 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232112988

Публикации

1. Бузиков Р.М., Казанцева О.А, Пилигримова Э.Г., Рябова Н.А., Шадрин А.М. Bacteriolytic Potential of Enterococcus Phage iF6 Isolated from "Sextaphag®" Therapeutic Phage Cocktail and Properties of Its Endolysins, Gp82 and Gp84 MDPI (Basel, Switzerland), 2023, 15(3), 767 (год публикации - 2023)
10.3390/v15030767

2. Казанцева О.А., Скорынина А.В., Пилигримова Э.Г., Рябова Н.А., Шадрин А.М. A Genomic Analysis of the Bacillus Bacteriophage Kirovirus kirovense Kirov and Its Ability to Preserve Milk MDPI, Basel, Switzerland, Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(16) (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241612584

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Бактериофаг vB_EfS_SE, способный инфицировать четыре вида рода Enterococci. Полный геном фага vB_EfS_SE был секвенирован с использованием технологии illumina. По результатам геномного анализа фаг относился к роду Saphexavirus. Ген эндолизина был клонирован в вектор экспрессии pBAD18. Два химерных эндолизина были сконструированы с использованием домена связывания углеводов (CBD) эндолизина vB_EfS_SE и замены его каталитического домена (EAD). Бактериофаг проявляет хороший бактериолитический потенциал: стабилен при температурах 40°C и ниже в диапазоне pH от 5 до 11. Длина геномной последовательности составляет 57 904 п.н. Эндолизин vB_EfS_SE PlySE и химерные эндолизины PlyIME-SE и PlySheep-SE имеют одинаковый диапазон специфичности, однако, разные свойства термостабильности и отличающийся диапазон pH активности ферментов. Таким образом, по результатам этой части работы и ранее опубликованным результатам исследований других лабораторий, мы можем высоко оценить потенциал фагов рода Saphexavirus и их эндолизинов как новых антибактериальных соединений. В 2024г был проведен подробный анализ разнообразия доменов эндолизинов, обнаруженных в бактериофагах, инфицирующих бациллы. В ходе работы была создана база данных эндолизинов этих бактериофагов, а их доменная архитектура была проанализирована с использованием базы данных NCBI, программ RASTtk, BLASTp, HHpred и InterPro. В 438 геномах фагов было обнаружено 454 гена эндолизинов. В найденных последовательностях эндолизинов идентифицировано восемь различных типов каталитических доменов и семь типов доменов связывания клеточной стенки. Филогенетический анализ эндолизинов был проведен с помощью MEGA X. Анализ показал, что многие типы доменов эндолизинов до сих пор не охарактеризованы экспериментально. В дальнейшем, изучение свойств таких доменов поможет раскрыть потенциал эндолизинов для создания новых антибактериальных средств. С помощью синтеза de novo были получены конструкции для экспрессии пяти эндолизинов в E.coli. Были выбраны эндолизины E.coli, содержащих EAD типа Peptidase_M15: PlyBB, PlyPony, Ply82G, PlyEld, Ply27.Каждый из эндолизинов являлся представителем отдельного филогенетического кластера. По результатам анализа спектра чувствительных бактериальных штаммов было установлено, что Ply27 обладал самым широким спектром антибактериальной активности – действовал на 42 штамма из 45! Таким образом нам удалось обнаружить эндолизин со спектром бактериолитического действия превосходящим ранее описанный нами Ply57, который был специфичен только против Bacillus cereus sensu lato. Эндолизин Ply27 действовал на B. cereus s.l., B. subtilis, B. pumilus, B. megaterium. Анализ генома штамма Bacillus sp. ATCC 14893, компонента пробиотика «Бактисубтил», позволил отнести этот микроорганизм к геномовиду Bacillus toyonensis, представители которого также часто применялись в качестве пробиотиков, в том числе и в животноводстве. B. toyonensis входит в группу бактерий Bacillus cereus sensu lato, представители которой способны синтезировать ряд факторов патогенности, вызывающих различные типы пищевых отравлений. Было установлено, что геном B. toyonensis IP 5832 содержит следующие гены факторов патогенности, типичные для Bacillus cereus sensu lato: негемолитического энтеротоксина (nheA, nheB, nheC), гемолизина BL (hblC , hblD, hblA и hblB), цереолизина О (clo), гемолизина III (hlyIII), три гена, кодирующие фосфолипазы С различной специфичности (cerA, cerB, plcB), а также набор генов, кодирующих протеолитические ферменты, которые участвуют в патогенезе (colQ1, inhA1, inhA2, inhA3, sfp, nprB, nprP2). Несмотря на то, что по результатам анализа TemPhD, геном этого штамма содержал профаг, наработать этот профаг для проведения детального анализа не удалось. Помимо генов факторов патогенности были выявлены устойчивости к антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу, эритромицину и канамицину. Антибиотикоустойчивые свойства штаммов были подтверждены экспериментально. Экспериментально были охарактеризованы три химерных фермента, представляющих собой эндолизин фага Ply57 на N-конце и деполимеразы поли-гамма-глутаминовой кислоты (PGA) на С-конце. Ply57-PghP, Ply57-KirTE и Ply57-EnvD были активны в отношении против L-PGA B. subtilis, однако только Ply57-PghP и Ply57-EnvD оказались способными разрушать D-PGA B. anthracis. Полученные три препарата ферментов тестировались на нескольких штаммах B. anthracis в сотрудничестве с ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск). Было исследовано восемь природных штаммов B. anthracis, отличающихся по последовательности оперона синтеза капсулы. Бактериолитические спектры полученных ферментов отличались. Литический спектр ply57-PghP был наиболее широк (5 из 8 штаммов). Ply57-KirTE четко лизировал только один штамм. По результатам проекта подготовлено три статьи, две из которых опубликованы в журналах первого квартиля: Pharmaceutics [Q1], Biomolecules [Q1], Microbiology (Pleiades). Работы представлены на 5 конференциях (Пущино, Санкт-Петербург, Новосибирск). Также, проведена командировка в Казанский Федеральный Университет, где один из исполнителей проекта приобрёл опыт работы с биоплёнками энтерококков, а также освоил методы их исследования с помощью флюоресцентной и конфокальной микроскопии.

Публикации

1. Кулябин В. А., Скорынина А. В., Бахтеева И. В., Зиновьева К. Ю., Тимофеев В. С., Шадрин А. М. Конструирование бактериолитической молекулы против Bacillus anthracis на основе эндолизина бактериофага Izhevsk Международная конференция «Бактериофаги: от фундаментальных исследований к применению» (год публикации - 2024)

2. Кулябин В.А., Скорынина А.В., Шадрин А.М. Создание рекомбинантного химерного белка Ply57_EnvD, объединяющего функции эндолизина и поли-гамма-D-глутамат деполимеразы 27-я Пущинская школа-конференция молодых ученых с международным участием «Биология – наука XXI века» (год публикации - 2024)

3. Копосова О.Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Использование биоинформатических методов для поиска бактериолитических ферментов бациллярных бактериофагов III Международная конференция «СОХРАНЕНИЕ И ПРЕУМНОЖЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ МИКРООРГАНИЗМОВ» (год публикации - 2024)

4. Бузиков Р.М., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Потенциал вирулентного бактериофага se для терапии антибиотико-резистентных энтерококковых инфекций Сборник тезисов 27-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА»., С.181 (год публикации - 2024)

5. Копосова О. Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Применение биоинформатических методов для создания базы данных эндолизинов бактериофагов группы Bacillus cereus sensu lato XI Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины — 2024 : сб. тез., C. 501 (год публикации - 2024)
10.25205/978-5-4437-1691-6-246

6. Казанцева О.А., Кулябин В.А., Копосова О.Н., Шадрин А.М. THE GENOME SEQUENCE OF BACILLUS TOYONENSIS STRAIN IP 5832, ISOLATED FROM THE PROBIOTIC “BACTISUBTIL,” CONTAINS GENES OF BACILLUS CEREUS PATHOGENICITY FACTORS AND ANTIBIOTIC RESISTANCE Pleiades Publishing, ISSN 0026-2617, Microbiology, 2024, Vol. 93, No. 6, pp. 973–981. © Pleiades Publishing, Ltd., 2024 (год публикации - 2024)
DOI: 10.1134/S0026261724606870

7. Бузиков Р. М., Казанцева О. А., Кулябин В. А., Шадрин А. М. Оценка возможностей бактериофага vB_EfS_SE для лечения инфекций, вызванных энтерококками Международная конференция «Бактериофаги: от фундаментальных исследований к применению" (год публикации - 2024)

8. Бузиков Р.М., Казанцева О.А., Рябова Н.А., Шадрин А.М. Оценка бактериофага vB_EfS_SE для борьбы с мультирезистентными энтерококками X Всероссийская Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» IV Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие» (год публикации - 2024)

9. Казанцева О.А., Кулябин В.А., Копосова О.Н., Шадрин А.М. Геном штамма Bacillus toyonensis IP 5832 – главного компонента пробиотика «Bactisubtil» содержит гены факторов патогенности Bacillus cereus и устойчивости к антибиотикам X Всероссийская Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» IV Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие» (год публикации - 2024)

10. Копосова О.Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Биоинформатический поиск перспективных антибактериальных ферментов бактериофагов, заражающих бактерии группы Bacillus Сборник тезисов 27-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием, С.40 (год публикации - 2024)

11. Кулябин В.А., Скорынина А.В., Шадрин А.М. Создание рекомбинантного химерного белка Ply57_EnvD, объединяющего функции эндолизина и поли-гамма-D-глутамат деполимеразы Сборник тезисов 27-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА», C.46 (год публикации - 2024)

12. Копосова О.Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Биоинформатический поиск перспективных антибактериальных ферментов бактериофагов, заражающих бактерии группы Bacillus 27-я Пущинская школа-конференция молодых ученых с международным участием «Биология – наука XXI века» (год публикации - 2024)

13. Казанцева О.А., Скорынина А.В., Пилигримова Э.Г., Рябова Н.А., Шадрин А.М Бактериофаг Kirovirus kirovense Kirov и его способность защищать молоко от контаминации Bacillus cereus sensu lato Сборник тезисов III Международной конференции «СОХРАНЕНИЕ И ПРЕУМНОЖЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ МИКРООРГАНИЗМОВ», С.69 (год публикации - 2024)

14. Кулябин В. А., Скорынина А. В., Бахтеева И. В., Зиновьева К. Ю., Тимофеев В. С., Шадрин А. М. Конструирование бактериолитической молекулы против Bacillus anthracis на основе эндолизина бактериофага Izhevsk Бактериофаги: от фундаментальных исследований к применению. Материалы международной конференции., С. 60 (год публикации - 2024)

15. Копосова О.Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Разработка и анализ базы данных эндолизинов бациллярных бактериофагов X Всероссийская Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» IV Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие» (год публикации - 2024)

16. Бузиков Р.М., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Потенциал вирулентного бактериофага se для терапии антибиотико-резистентных энтерококковых инфекций 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых с международным участием «Биология – наука XXI века» (год публикации - 2024)

17. Копосова О.Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Diversity of Endolysin Domain Architectures in Bacteriophages Infecting Bacilli Biomolecules, Biomolecules 2024, 14(12), 1586; (год публикации - 2024)
10.3390/biom14121586

18. Копосова О. Н., Казанцева О. А., Шадрин А. М. Анализ доменной структуры эндолизинов бациллярных бактериофагов Бактериофаги: от фундаментальных исследований к применению. Материалы международной конференции, С. 52 (год публикации - 2024)

19. Бузиков Р. М., Казанцева О. А., Кулябин В. А., Шадрин А. М. Оценка возможностей бактериофага vB_EfS_SE для лечения инфекций, вызванных энтерококками Бактериофаги: от фундаментальных исследований к применению. Материалы международной конференции., C.12 (год публикации - 2024)

20. Копосова О. Н., Казанцева О. А., Шадрин А. М. Анализ доменной структуры эндолизинов бациллярных бактериофагов Международная конференция «Бактериофаги: от фундаментальных исследований к применению» (год публикации - 2024)

21. Казанцева О.А., Скорынина А.В., Пилигримова Э.Г., Рябова Н.А., Шадрин А.М Бактериофаг Kirovirus kirovense Kirov и его способность защищать молоко от контаминации Bacillus cereus sensu lato III МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (год публикации - 2024)

22. Бузиков Р.М., Кулябин В.А., Копосова О.Н., Арляпов В.А., Шадрин А.М. Characteristics of the Enterococcus Phage vB_EfS_SE, and the Properties of Its Chimeric Endolysins Harboring a PlySE-Carbohydrate-Binding Domain and a Synthetic Enzymatic Domain Pharmaceutics, Pharmaceutics 2024, 16, 1312. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.3390/pharmaceutics16101312

23. Кулябин В.А., Бузиков Р.М., Шадрин А.М. Характеристика и сравнение бактериолитических свойств эндолизина PlySE бактериофага энтерококков vB_EfS_SE и его химерных производных X Всероссийская Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» IV Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие» (год публикации - 2024)

24. Копосова О.Н., Казанцева О.А., Шадрин А.М. Использование биоинформатических методов для поиска бактериолитических ферментов бациллярных бактериофагов Сборник тезисов III Международной конференции «СОХРАНЕНИЕ И ПРЕУМНОЖЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ МИКРООРГАНИЗМОВ», С.39 (год публикации - 2024)

Возможность практического использования результатов
- формирование научных и технологических заделов по биобезопасности на основе фермента Ply57-EnvD для борьбы с возбудителем сибирской язвы. Требуются клинические испытания. - эндолизины и деполимеразы, как коллекция ДНК экспрессионных векторов и база данных, для использования в синтетической биологии как бактериолитические ферменты, элементы синтетических бактериофагов. В перспективе, с помощью полученных результатов можно будет совершенствовать существующие препараты бактериофагов и быстро проводить их оптимизацию для проведения индивидуальных антибактериальных средств для фаготерапии антибиотикоустойчивых бактериальных инфекций.