Ингибиторы вирусного слияния с липидоопосредованным механизмом действия как новая парадигма для создания препаратов с прямым противовирусным действием для терапии инфекций, вызванных бета-коронавирусами, в том числе, SARS-CoV-2

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00417

НазваниеИнгибиторы вирусного слияния с липидоопосредованным механизмом действия как новая парадигма для создания препаратов с прямым противовирусным действием для терапии инфекций, вызванных бета-коронавирусами, в том числе, SARS-CoV-2

Руководитель Остроумова Ольга Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-231 - Инфекционные заболевания

Ключевые слова мембраны, липидные бислои, липосомы, липидные везикулы, ингибиторы вирусного слияния, пептиды слияния, растительные полифенолы, флавоноиды, алкалоиды, антимикробные липопептиды, пептид-липидные и липид-липидные взаимодействия, спонтанная кривизна, дипольный потенциал мембраны

Код ГРНТИ34.15.35, 34.17.27, 76.03.41

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В настоящее время наблюдается нехватка противовирусных препаратов прямого действия, которые могут быть использованы для борьбы с COVID-19. Нацеленность имеющихся фармпрепаратов на белковые мишени, гены которых быстро мутируют, формируя устойчивые формы вирусных патогенов, определяет необходимость поиска альтернативных стратегий. Предлагаемый проект направлен на обоснование возможности использования липидной оболочки бета-коронавирусов в качестве мишени для действия инновационных противовирусных препаратов прямого действия. Бета-коронавирусы, ассоциированные с тяжелыми респираторными патологиями человека, такие как, MERS-CoV, SARS-CoV и SARS-CoV-2, имеют липидную оболочку, которая должна слиться с мембраной клетки-мишени для того, чтобы вирусы могли проникнуть в клетку, и произошло заражение. Суть предлагаемого подхода заключается в поиске малых молекул, которые меняют свойства мембран таким образом, чтобы слияния и последующего заражения не произошло. Препараты с подобным механизмом действия могут быть рекомендованы для постоянного применения с целью предотвращения заражения и будут особенно актуальны в период пандемии COVID-19. Существенным преимуществом использования липидной оболочки вируса в качестве мишени является ожидаемое отсутствие штамм-специфичности действия препаратов, а также низкая вероятность развития устойчивости, поскольку липидная оболочка значительно менее подвержена изменениям по сравнению с белковыми мишенями. В условиях пандемии и нехватки времени на разработку принципиально новых противовирусных препаратов, акцент в проекте будет сделан на перепрофилирование уже имеющихся на фармрынке субстанций, поскольку для них определены профиль безопасности и фармакокинетические характеристики, и они могут быть в кратчайшие сроки переориентированы на борьбу с COVID-19. К настоящему моменту нами получены приоритетные данные о противовирусной активности алкалоида черного перца пиперина, входящего в состав множества коммерчески доступных БАД. В ходе работы планируется провести скрининг библиотеки мембраноактивных соединений, полифенолов и алкалоидов растительного происхождения, а также синтетических и природных антимикробных липопептидов, на предмет возможности ингибирования слияния модельных липидных бислоев, имитирующих состав вирусных и клеточных мембран. Слияние модельных липидных мембран будет индуцировано различными способами: введением кальция, полиэтиленгликолей с высокой молекулярной массой и различных фрагментов пептидов слияния SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-COV-2. Для оценки эффективности слияния будет применен комплексный подход, включающий флуориметрические, микроскопические, калориметрические и электрофизиологические методы. Параллельно проведенные количественные измерения изменений физико-химических свойств мембран при введении тестируемых соединений с потенциальной противовирусной активностью позволят определить роль электрических и эластических свойств липидного матрикса в слиянии вирусов с клетками-мишенями. Это позволит выявить соединения, которые могут быть рассмотрены в качестве потенциальных ингибиторов вирусного слияния с липидоопосредованным механизмом действия. Продемонстрировавшие наибольшую эффективность на бесклеточных системах соединения будут протестированы с использованием клеточных систем и различных штаммов SARS-CoV-2. Результатом реализации проекта станет формирование новой парадигмы борьбы с инфекциями, вызванными оболочечными вирусами, связанными с тяжелыми респираторными патологиями человека, с помощью ингибиторов вирусного влияния с липидоопосредованным механизмом действия и создание научно-технического задела для их использования при профилактике и терапии COVID-19.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ефимова С.С., Мартынюк В.А., Захарова А.А., Юдинцева Н.М., Чернов Н.М., Яковлев И.П., Остроумова О.С. Chromone-containing allylmorpholines influence ion channels in lipid membranes via dipole potential and packing stress International Journal of Molecular Sciences, V. 23, P. 11554. (год публикации - 2022)
10.3390/ijms231911554

2. Захарова А.А., Ефимова С.С., Остроумова О.С. Lipid microenvironment modulates the pore-forming ability of polymyxin B. Antibiotics, V. 11, P. 1445. (год публикации - 2022)
10.3390/antibiotics11101445

3. Чернышова Д.Н., Тюлин А.А., Остроумова О.С., Ефимова С.С. Discovery of the potentiator of the pore-forming ability of lantibiotic nisin: perspectives for anticancer therapy Membranes, 2022, 12, 1166. (год публикации - 2022)
10.3390/membranes12111166

4. Ефимова С.С., Злодеева П.Д., Шекунов Е.В., Остроумова О.С. Механизмы ингибирования слияния липидных везикул экстрактами чаги и листьев облепихи Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 39 (5): стр. 355-363. (год публикации - 2022)
10.31857/S0233475522050048

5. Злодеева П.Д., Шекунов Е.В., Остроумова О.С., Ефимова С.С. The degree of hydroxylation of phenolic rings determines the ability of flavonoids and stilbenes to inhibit calcium-mediated membrane fusion. Nutrients, 15, 5, 1121 (год публикации - 2023)
10.3390/nu15051121

6. Шекунов Е.В., Злодеева П.Д., Ефимова С.С., Мурылева А.А., Зарубаев В.В., Слита А.В., Остроумов О.С. Cyclic lipopeptides as membrane fusion inhibitors against SARS-CoV-2: new tricks for old dogs Antiviral Research, 212: 105575 (год публикации - 2023)
10.1016/j.antiviral.2023

7. Остроумова О.С., Ефимова С.С. Lipid-Centric Approaches in Combating Infectious Diseases: Antibacterials, Antifungals and Antivirals with Lipid-Associated Mechanisms of Action Antibiotics, 12, 1716 (год публикации - 2023)
10.3390/antibiotics12121716

8. Шекунов Е.В., Ефимова С.С., Кевер Л.В., Ишманов Т.Ф., Остроумова О.С. Lipid Selectivity of Membrane Action of the Fragments of Fusion Peptides of Marburg and Ebola Viruses International Journal of Molecular Sciences, 25: 9901 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25189901

9. Мартынюк В.А., Ефимова С.С., Малыхина А.И., Остроумова О.С. The effects of plant flavones on the membrane boundary potential and lipid packing stress Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 245: 114269 (год публикации - 2025)
10.1016/j.colsurfb.2024.114269

10. Остроумова О.С., Ефимова С.С., Злодеева П.Д., Александрова Л.А., Макаров Д.А., Матюгина Е.С., Сохарева В.А., Хандажинская А.Л., Кочетков С.Н. Derivatives of pyrimidine nucleosides affect artificial membranes enriched with mycobacterial lipids Pharmaceutics, 16(9): 1110 (год публикации - 2024)
10.3390/pharmaceutics16091110

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Разработаны бесклеточные тест-системы для детекции слияния липидых везикул под действием фрагментов пептидов слияния вирусов Марбург (523-DLAAGLSWIPFFGPGIE-542) и Эбола (523-HNAAGIAWIPYFGPGAE-541), которые гомологичны фрагментам пептидов слияния вируса Марбурга (штамм Lake Victoria/Angola-05) и Эбола (штамм Su-dan/Uganda-00) соответственно. Флуоресцентный анализ и электронная микроскопия позволили провести количественную оценку фузогенной активности пептидов и идентифицировать липидные детерминанты, влияющие на слияние мембран под действием фрагментов пептидов слияния вирусов Марбург и Эбола. Показано, что тестируемый фрагмент пептида слияния вируса Марбург характеризуется более высокой фузогенной активностью в отношении липосом, включающих фосфатидилхолин, сфингомиелин и холестерин, по сравнению с гомологичным фрагментом пептида слияния вируса Эбола. Установлено, что включение фосфатидилэтаноламина в состав липидных везикул приводит к 5-кратному падению фузогенной активности фрагмента пептида слияния вируса Марбург и 25%-потенцированию активности фрагмента пептида слияния вируса Эбола. Замена в составе липосом нейтрального фосфатидилхолина на анионный фосфатидилсерин сопровождается уменьшением фузогенной активности обоих пептидов в 1.5-1.8 раз. С использованием дифференциальной сканирующей микрокалориметрии выявлено, что уменьшение длины углеводородных хвостов фосфатидилхолина сопровождается ростом способности пептидов уменьшать температуру и энтальпию основного фазового перехода мембранообразующих липидов, причем фрагмент пептида слияния вируса Марбург оказывает более выраженный эффект по сравнению с гомологичной последовательностью вируса Эбола. Фрагменты пептидов слияния вирусов Марбург и Эбола увеличивают деконволюцию пика, соответствующего плавлению ДМФС, и относительный вклад более тугоплавкой компоненты. Проведена оценка способности нескольких растительных метаболитов ингибировать слияние липидных везикул под действием фрагмента пептида слияния вируса Марбург. Фисетин и пиперин не обладают ингибирующей активностью, в то время как мирицетин и кверцетин способны предотвращать слияние везикул, вызванное фрагментом пептида слияния вируса Марбург (индекс ингибирования составляет 30-40%). На основании полученных данных выдвинуто предположение о превалирующей роли дегидратации мембраны в фузогенном действии фрагмента пептида слияния вируса Марбург, и способности высокогидроксилированных флавонолов ингибировать его активность за счет изменения полярных взаимодействий на поверхности мембраны. Флуориметрическая оценка способности ряда растительных флавонов подавлять кальций-индуцированное слияние отрицательно заряженных липидных везикул показала, что эффективность при концентрации 20 мкМ снижается в ряду: байкалеин ≈ скутеллареин ≈ морин (индекс ингибирования составляет около 80%) > лютеолин (индекс ингибирования около 50%) > апигенин (индекс ингибирования не превышает 20%) > фисетин ≈ вогонин ≈ хризин (индекс ингибирования не превышает 10%). При этом, выраженность влияния тестируемых флавонов на температуру фазового перехода димиристоилфосфохолина увеличивается в следующем ряду: лютеолин < морин < вогонин ≈ скутеллареин ≈ апигенин < хризин ≤ байкалеин < фиcетин. Введение байкалеина, хризина и фисетина также вызывает значительное снижение резкости/кооперативности фазового перехода липидов, что выражается в увеличении ширины основного пика, соответствующего плавлению мембранных липидов. Таким образом, сопоставление индекса ингибирования и модуля снижения температуры плавления для ряда флавонов не выявило значимой корреляции. Сравнительный анализ химических структур тестируемых флавоноидов позволяет заключить, что способность флавонов подавлять кальций-опосредованное слияние мембран увеличивается с ростом общего числа гидроксильных групп и увеличением дисбаланса между степенью гидроксилирования двух бензольных колец, фланкирующих молекулу флавона. Полученные данные хорошо согласуются с результатами исследования ингибирования кальций-опосредованного слияния отрицательно заряженных липидных везикул другими растительными полифенолами, проведенного на предыдущем этапе проекта (Zlodeeva et al., Nutrients, 2023). По результатам работы в отчетном периоде опубликовано 3 статьи в высокорейтинговых зарубежных журналах «Pharmaceutics» (Q1 по WoS/SJR, IF 4.9), «International Journal of Molecular Sciences» (Q1 по WoS/SJR, IF 4.9) и «Colloids and Surfaces B: Biointerfaces» (Q1 по WoS/SJR, IF 5.4).

Публикации

Возможность практического использования результатов
Создан научно-технический задел для разработки новых противовирусных препаратов на основе природных соединений, а также перепрофилирования известных лекарственных средств.