Исследование коннектомов раковых опухолей для идентификации нового типа терапевтических мишеней - контактов раковых клеток с окружающей стромой

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00483

НазваниеИсследование коннектомов раковых опухолей для идентификации нового типа терапевтических мишеней - контактов раковых клеток с окружающей стромой

Руководитель Алексеенко Ирина Васильевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-208 - Онкология

Ключевые слова Метастазирующий рак, клеточные взаимодействия, опухоль-ассоциированные фибробласты, транскриптом, молекулы адгезии, онкогенные синапсы, геномное редактирование

Код ГРНТИ76.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Солидные опухоли секретируют в кровоток большое количество высокогетерогенных циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Однако, только небольшая часть циркулирующих опухолевых клеток может выжить и в конечном итоге дать начало новой опухоли. Эффективное метастазирование (> 90%) ассоциировано с комплексами опухолевых клеток, иногда называемыми циркулирующими микроэмболиями опухоли, определяемыми как группы из двух или более ЦОК. В то время как отдельные ЦОК могут испытывать проблемы с выживанием, такие как окислительный стресс и иммунные эффекты, ведущие к апоптозу, ЦОК в комплексах остаются защищенными. Максимальным метастатическим потенциалом обладают опухолевые комплексы, содержащие опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ), которые обеспечивают микросреду, благоприятную для выживания раковых клеток. Роль ОАФ в метастазировании широко изучена. Показано, что взаимодействия между ОАФ и раковыми клетками способствуют инвазии и метастазированию. ОАФ способны индуцировать образование метастазирующих опухолевых комплексов в том числе посредством белков межклеточной адгезии. Впервые метастазирующие опухолевые комплексы были найдены в асцитах пациенток с карциномой яичников. Находясь в брюшной полости, раковые клетки объединяются со свободно плавающими клетками миофибробластов, образуя гетеротипические комплексы. Это позволяет раковым клеткам выживать и приобретать более инвазивный фенотип. Несмотря на многочисленные исследования межклеточных взаимодействий в опухоли, механизмы взаимодействия ОАФ с раковыми клетками во время их коллективной миграции все еще далеки от понимания. В частности, остается нетронутым вопрос о том, формируются ли во время метастазирования кластеры взаимодействий (синаптоподобные структуры) между раковыми клетками и ОАФ и какие гены участвуют в их формировании. В ходе данного проекта будет предпринята попытка идентификации кластеров (синапсоподобных структур) взаимодействий раковых клеток и ОАФ при их совместном метастазировании, а также поиск возможностей для их разрушения. Идентификация синаптоподобных структур и генов, участвующих в их образовании, может дать начало новым подходам к лечению рака, разрушающим эти кластеры. Такие подходы смогут дополнить терапию с использованием иммунных контрольных точек, которая также направлена на нарушение взаимодействий между раковыми клетками и клетками иммунной системы. В проекте будут использованы самые современные методы молекулярной биологии: омиксные технологии (транскриптомный и протеомный анализ), методы геномного редактирования (в том числе CRISPR-Cas), конфокальная микроскопия, биоинформатический анализ (в том числе подход Connectivity Map). Исследование будет выполняться на раковых клетках и ОАФ, полученных из первичных и вторичных опухолей пациентов, в условиях in vitro (ко-культуры раковых клеток и ОАФ) и in vivo (ксенографтные опухолевые модели на nude/с мышах). В рамках данного проекта планируется решить следующие задачи: 1. На основе опубликованных данных транскриптомного и протеомного анализа циркулирующих в крови опухолевых комплексов выбрать поверхностные белки – кандидаты на роль посредников во взаимодействиях раковых и стромальных клеток в метастазирующих комплексах 2. Выделить раковые клетки из первичных опухолей и метастатических очагов пациентов с метастатическим раком. Провести сравнительный транскриптомный анализ раковых клеток из первичных очагов и из метастазов с целью выявления ключевых белков, осуществляющих взаимодействия между раковыми и стромальными клетками 3. Провести поиск кластеров (синаптоподобных структур) в 3D ко-культурах выделенных из опухолей раковых и стромальных клеток с помощью конфокальной микроскопии. Определить белковый состав найденных кластеров с помощью масс-спектрометрии. 4. Получить раковые клетки, в которых экспрессия выявленных генов, ответственных за образование кластеров, будет подавлена с помощью технологии геномного редактирования или генного нокдауна. Провести транскриптомный анализ, а также функциональные тесты подвижности и инвазивности нативных и полученных вариантов раковых клеток. Отобрать те гены, инактивация которых будет связана со снижением способности раковых клеток взаимодействовать с ОАФ и снижением их метастатического потенциала 5. Сравнить метастатический потенциал нативных и модифицированных раковых клеток путем прививания раковых клеток иммунодефицитным мышам. Это позволит выбрать гены кластеров, подавление которых оказывает наибольшее влияние на метастатический потенциал раковых клеток. 6. При помощи биоинформатического анализа, в том числе подхода Connectivity Map, предсказать препараты, оказывающие сходный с подавлением экспрессии выявленных генов эффект на раковые клетки. 7. В экспериментах in vitro провести сравнение эффектов предсказанных препаратов и подавления экспрессии выявленных генов на подвижность и инвазивность раковых клеток, а также на их способность взаимодействовать с фибробластами. Влияние таких препаратов на формирование кластеров между раковыми клетками и ОАФ будет изучено с помощью конфокальной микроскопии. Таким образом, в ходе проекта не только будут получены новые фундаментальные знания о раково-стромальных взаимодействиях, но также будут получены данные о влиянии изменений этих взаимодействий на прогрессию опухоли. Впервые будет проведена прямая проверка гипотезы о существовании синаптоподобной структуры между раковыми клетками и ОАФ. Такая информация может послужить основой для разработки новых или усовершенствования имеющихся терапевтических подходов, направленных на микроокружение опухоли.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Алексеенко И.В., Кондратьева Л.Г, Чернов И.П., Свердлов Е.Д. From the Catastrophic Objective Irreproducibility of Cancer Research and Unavoidable Failures of Molecular Targeted Therapies to the Sparkling Hope of Supramolecular Targeted Strategies International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(3), 2796 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24032796

2. Антонова Д.В., Гнатенко Д.А., Котова Е.С., Плешкан В.В., Кузьмич А.И., Свердлов Е.Д., Алексеенко И.В. Cell-specific expression of the FAP gene is regulated by enhancer elements Frontiers in Molecular Biosciences, 2023 Feb 7;10:1111511. (год публикации - 2023)
10.3389/fmolb.2023.1111511

3. Розенберг Ю.М., Буздин А.А., Мохаммад Т., Ракитина О.А., Дидыч Д.А., Плешкан В.В., Алексеенко И.В. Molecules promoting circulating clusters of cancer cells suggest novel therapeutic targets for treatment of metastatic cancers Frontiers in Immunology, 2023 Mar 15;14:1099921. (год публикации - 2023)
10.3389/fimmu.2023.1099921

4. Плешкан В.В., Зиновьева М.В., Антонова Д.В., Алексеенко И.В. Spheroids of FAP-Positive Cell Lines as a Model for Screening Drugs That Affect FAP Expression Biomedicines, Biomedicines 2023, 11(7), 2017 (год публикации - 2023)
10.3390/biomedicines11072017

5. Алексеенко И., Жукова Л., Кондратьева Л., Буздин А., Чернов И., Свердлов Е. Tumor Cell Communications as Promising Supramolecular Targets for Cancer Chemotherapy: A Possible Strategy International Journal of Molecular Sciences , 25(19), 10454 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms251910454

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведена оценка влияния инактивации выбранных генов поверхностных белков, потенциально способных осуществлять взаимодействия между раковыми и стромальными клетками (ПБК-РСК), на туморогенность и метастатический потенциал раковых клеток in vivo на иммунодефицитных мышах NudeJ с привитой клеточной линией рака молочной железы MDA-MB231 посредством временного подавления экспрессии генов с помощью siRNA в комплексе с липидными наночастицами. В эксперименте исследовали следующие группы: 1) siFADD, 9 мкг; 2) siFADD/2, 4.5 мкг; 3) siCD44 + ICAM1, 4.5 мкг + 4.5 мкг; 4) Scramble, 9 мкг - неспецифическая siRNA, 5) PBS (фосфатный буфер). Введение siRNA производили двукратно с интервалом 5 дней, эффект от введения оценивали по количеству некротических и апоптотических клеток в опухоли, а также по потенциалу метастазирования в региональные лимфоузлы (РЛУ). Наименьшее количество апоптотических клеток по сравнению с контрольной группой наблюдалось в группах siFADD и siFADD/2, эффект на количество таких клеток был дозозависим. В 2 из 4 образцов РЛУ для групп siFADD и siFADD/2 наблюдался рост клеток, морфологически схожих с клетками линии MDA-MB231, при этом для групп Scramble и PBS роста клеток не наблюдалось. Предположительно, siFADD в данной модельной системе увеличивает устойчивость клеток к апоптозу, что могло потенциировать появление более агрессивных клонов раковых клеток. Однако, необходимы дополнительные исследования для подтверждения данного предположения. С помощью биоинформатического подхода были предсказаны препараты, способные оказывать эффект на раковые клетки (РК), сходный с подавлением экспрессии генов ПБК-РСК (FADD, SELL и CD44). Выявлено 12 препаратов, для дальнейших экспериментов были выбраны фамцикловир (Fam, в концентрации 0,75 мкМ) и иматиниб (Ima, в концентрации 1,1 мкМ), поскольку генные сигнатуры, характерные для этих препаратов в таких концентрациях были выявлены на клеточных линиях РМЖ человека, что наиболее соответствует используемым в ходе Проекта образцам человеческих опухолей. Влияние выбранных препаратов на пролиферацию и жизнеспособность клеток РМЖ MCF7 и MDA-MB231 было оценено при помощи MTS-теста в широком диапазоне концентраций. Подавление роста клеток MCF7 и MDA-MB231 при обработке Fam наблюдалось только при использовании высокой концентрации препарата (18,75 мМ). В случае Ima наблюдалось подавление роста клеток при использовании концентрации 100 мкМ. Влияние препаратов на экспрессию генов FADD, CD62L и CD44 было оценено с помощью РТ-ПЦР. Было выявлено, что обработка клеток линии MCF7 0,75 мкМ Fam приводит к повышению экспрессии всех исследуемых генов не менее чем в 1,5 раза. В случае линии MDA-MB231 наблюдали двукратное снижение уровня экспрессии гена CD44. Использование 1,1 мкМ Ima приводило к повышению уровня экспрессии генов FADD и CD44, а также снижению уровня экспрессии CD62L в клетках линии МСF7. В случае линии MDA-MB231, наблюдали подавление уровня экспрессии гена FADD более чем в два раза. Было показано, что использование Fam и Ima в концентрациях 0,75 мкМ и 1,11 мкМ соответственно приводит к подавлению миграции MDA-MB-231 и MCF7. В то время как для Ima ранее был показан эффект на миграцию раковых клеток, для Fam такой эффект был выявлен впервые. Подавление экспрессии каждого из генов ПБК-РСК с помощью siRNA также приводило к значительному снижению миграционной активности клеток РМЖ. Было изучено влияние препаратов Fam и Ima на способность к формированию гетеросфероидов, состоящих из клеток РМЖ MCF7, MDA-MB231 и NuMDA (представляла собой суспензию опухолевых клеток, полученных от мышей NudeJ после перевивки MDA-MB231), и первичных опухоль-ассоциированных фибробластов (ОАФ) человека - BC1, полученных ранее в рамках Проекта. Способностью к формированию гетеросфероидов с ОАФ, в том числе, в присутствии Fam/Ima, обладали все 3 клеточные линии, при этом гетеросфероиды MCF7 обладали правильной формой. Был исследован эффект подавления экспрессии генов ПБК-РСК на формирование межклеточных взаимодействий между раковыми клетками и ОАФ. При исследовании эффекта siRNA на сфероиды MCF7 было выявлено, что использование siCD62L приводит к потере мембранной локализации белка CD62L, подтверждая ранее полученные методом ОТ-ПЦР данные о подавлении экспрессии соответствующего гена. В случае ко-культур MCF7/ОАФ потери мембранной локализации CD62L при использовании siCD62L не наблюдали. Наоборот, наблюдали усиление сигнала CD62L, аналогичное отмеченному ранее в гетеросфероидах MCF7/ОАФ. Был исследован эффект препаратов фамцикловир и иматиниб, выявленных в рамках транскриптомного анализа, на формирование межклеточных взаимодействий на основе ПБК-РСК между раковыми клетками и ОАФ. Обработка сфероидов MCF7 препаратами Fam/Ima не приводила к изменению в экспрессии CD62L, однако, наблюдали небольшое усиление экспрессии PODXL. В случае гетеросфероидов MCF7/ОАФ, использование Fam приводило к ингибированию экспрессии белка CD62L, а использование Ima – к усилению его экспрессии. В случае гетеросфероидов MDA-MB231/ОАФ, наблюдали усиление цитоплазматической локализации белка PODXL по сравнению с моносфероидами. Одновременно, обработка гетеросфероидов MDA-MB231/ОАФ препаратами приводила к ингибированию цитоплазматической локализации PODXL. В случае гетеросфероидов NuMDA/ОАФ наблюдали формирование кластеров распределения белка PODXL, а при обработке данных гетеросфероидов препаратами Fam/Ima – усиление экспрессии данного белка, а также стимуляцию его мембранной локализации. Таким образом, с помощью биоинформатического подхода были выявлены препараты, способные подавлять миграцию раковых клеток, аналогично подавлению экспрессии генов ПБК-РСК. Стоит отметить, что наблюдаемое подавление миграции клеток, связанное с подавлением экспрессии генов ПБК-РСК, может объясняться пред-гибельным состоянием клеток. Помимо этого, была показана возможность возникновения сверх-агрессивных клонов MDA-MB231 при подавлении экспрессии гена FADD с помощью siRNA in vivo. Исследование механизмов наблюдаемого эффекта в дальнейшем могло бы пролить свет на некоторые механизмы возникновения лекарственной устойчивости в опухолях, или привести к открытию новых. Были рассмотрены альтернативные варианты возможного воздействия на кластеры лиганд-рецепторных взаимодействий, которые представлены в публикации (Doi: 10.3390/ijms251910454)

Публикации

Возможность практического использования результатов
Лечение рака проблематично. противоопухолевые подходы такие как химиотерапия, лучевая терапия, гормональная и таргетная терапия не полностью оправдали ожидания. На основе недавней литературы и результатах, полученных в ходе данного Проекта можно предложить новое направление в терапии рака, которое нацелено на связи между раковыми клетками и их микроокружением. Раково-стромальные синапсы представляют собой привлекательную мишень для этого подхода. Такие синапсы образуют лигандно-рецепторные кластеры на границе взаимодействующих клеток. Синапсы предоставляют собой пространство для целенаправленного обмена межклеточными сигнальными молекулами. Таким образом, разрушение раково-стромальных синапсов может потенциально вызвать разрушение опухолей. Кроме того, кластерное расположение компонентов синапса дает возможности для повышения безопасности и точности лечения. создаваемый в рамках реализации проекта противоопухолевый подход обещает быть универсальным, относительно простым и экономически эффективным. Мы также надеемся, что, в отличие от химиотерапевтических и иммунных препаратов, которые взаимодействуют с одной целью, при использовании в качестве мишени супрамолекулярных больших кластеров, которые включают множество различных компонентов в качестве цели, возникновение резистентности, характерной для химио- и иммунотерапии, крайне маловероятно.