Получение инкапсулированных фитаз С и Д на основе клеток рекомбинантного продуцента из дрожжей Yarrowia lipolytica с целью повышения эффективности потребляемого корма

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-16-00093

НазваниеПолучение инкапсулированных фитаз С и Д на основе клеток рекомбинантного продуцента из дрожжей Yarrowia lipolytica с целью повышения эффективности потребляемого корма

Руководитель Исакова Елена Павловна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-204 - Животноводство

Ключевые слова Фитаза, корма, привесы, продуцент, микрокапсула, пищеварение, рекомбинантный, продуцент, птицеводство, Yarrowia lipolytica

Код ГРНТИ62.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Использование ферментов в производстве кормов для животноводства во всем мире рассматривается как незаменимый технологический инструмент, позволяющий максимально эффективно использовать доступное фуражное сырье, повышать привесы, сокращать затраты на минеральные добавки. Фитазы (эстеразы, гидролизующие 1,2,3,4,5,6-гексафосфат миоинозитола) являются одним из наиболее востребованных типов ферментов кормового назначения. Это обусловлено тем, что более 65% фосфора, содержащегося в зерне злаков, и около 30% - в соевых бобах приходится на долю фитата, который не поддается гидролизу в желудочно-кишечном тракте свиней, птицы, рыбы и других продуктивных животных. В структурном и энзиматическом отношении известные в различных царствах живого мира фитазы делятся на 4 класса, из которых в кормопроизводстве нашли применение ферменты классов PhyA и PhyC. Класс PhyA представлен преимущественно у грибов-дейтеромицетов, которые и служат для их промышленного производства в секреторной форме. Как правило, эти ферменты сильно гликозилированы, обладают высокой термостабильностью, двумя рН-оптимумами активности (в среднем, рН2,5 и рН5,5), с точки зрения субстратной специфичности относятся к 3-фитазам (с высокой скоростью расщепляют фосфоэфирные связи в 1, 3 и 5 положениях кольца миоинозитола). Фитазы класса PhyC встречаются у бактерий группы кишечной палочки и в лизосомах животных. В отличие от класса PhyA, эти ферменты обладают одним рН-оптимумом в диапазоне 5,0-6,0, термостабильностью до 55-60оС и субстратной специфичностью типа 6-фитаза (предпочтение к расщеплению той или иной фосфоэфирной связи по отношению к ранее образованной свободной гидроксильной группе миоинозитола не выражено). Практическое применение фитаз класса PhyС осложнено тем, что в естественных условиях они не секретируются, а накапливаются в периплазме или лизосомах. Поэтому создание секретирующих продуцентов этих ферментов требует использования рекомбинантных технологий (наиболее популярными продуцентами являются метилотрофные дрожжи). Технологическим недостатком фитаз класса PhyС по сравнению с PhyA является их низкая термостабильность, не позволяющая вводить их в состав премиксов с использованием распылительной сушки, где процесс гранулирования идёт при 70-80оС. Однако, фитазы класса PhyС обладают существенно более высокой удельной активностью в условиях желудочно-кишечного тракта продуктивных животных по сравнению с фитазами типа PhyA. За счёт менее выраженной субстратной специфичности к фософэфирным связям в различных положениях кольца миоинозитола они обеспечивают более полное высвобождение фосфора из зернового фитата. Поэтому в последние годы интерес производителей и потребителей к фитазам класса PhyС неуклонно растёт. Фитазы классов PhyB и PhyD не имеют практического применения в кормопроизводстве из-за того, что для них не созданы достаточно удобные для биотехнологического производства продуценты, и они не обеспечивают полного высвобождения фосфора из зернового фитата. Между тем, фитазы класса PhyD микробного (бациллярного) и растительного происхождения по своему рН-оптимуму (7,0-7,8) и высокой термостабильности могут претендовать на применение при производстве комбикормов. Ранее заявителями настоящего проекта предложена не имеющая аналогов технология производства фитазы класса PhyС из энтеробактерии Obesumbacteium proteus. Она заключается в отказе от производства фермента в секреторной форме: рекомбинантный продукт накапливается в цитоплазме рекомбинантных клеток экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica. Несмотря на то, что такой продуцент уступает по выходу продукта в расчете на 1 л культуральной среды секретирующим аналогам – рекомбинантным штаммам на основе Y. lipolytica, метилотрофных дрожжей и плесневых грибов, он имеет целый ряд технологических преимуществ. Главными из них являются: (1) возможность использования продуцента фитазы для биоремедиации отходов и стоков боен и маслоэкстрационного производства с образованием комбинированной белково-ферментной кормовой добавки – при этом происходит очистка отходов и стоков от гидропероксидов и ксенобиотиков, исчезает необходимость отделять биомассу от растворимой фазы среды, что существенно сокращает расходы на сепарацию и сушку ферментной добавки, сводит к нулю образование отходов биотехнологического производства; (2) за счёт микроинкапусляции в клетках дрожжей-продуцентов существенно возрастает термостабильность фитазы по сравнению с внеклеточной формой, что улучшает её совместимость с технологией распылительной сушки премиксов; (3) за счёт микроинкапсуляции на порядок и более сокращаются непроизводительные потери фермента за счёт кислотной денатурации и протеолиза при прохождении желудка скота и птицы. В рамках настоящего проекта предлагается изучить динамику высвобождения инкапуслированной фитазы O. proteus из кормовой добавки, получаемой культивированием рекомбинантного продуцента Y. lipolytica на полужидких отходах бойни, при кормлении цыплят и перепелок кормами промышленного производства, различающимися по содержанию фитата. Эти данные позволят наиболее адекватно оценить реальный эффект от применения растворимых фитаз, выпускаемых по существующим промышленным технологиям. За счёт использования специально изготовленного образца деинкапсулированной фитазы O. proteus путём ультразвуковой гомогенизации микрокапсул перед скармливанием позволит впервые корректно сравнить вклад микроинкапсулирования в повышение эффективности действия фитазы в желудочно-кишечном тракте птицы. Предлагается также создать несекретирующий рекомбинантный продуцент фитазы класса PhyD из Bacillus subtilis на основе Y. lipolytica и сопоставить эффективность получаемой на его основе кормовой добавки с микроинкапуслированным ферментом в качестве средства улучшения переваримости зернового комбикорма. Будут проведены сравнительные исследования эффективности микроинкаспулированных фитаз из O. proteus и B. subtilis с аналогичными ферментами в свободной форме, а также коммерческими фитазами класса PhyА. Ещё одним полностью оригинальным результатом будет создание промышленно пригодной технологии производства бактериальной фитазы класса PhyD из B. subtilis. Технология будет основана на уникальном принципе микроинкапсуляции, ранее примененном только на одном примере – фитазе O. proteus. Впервые будет использована технология производства фитазы класса PhyC из энтеробактерии Obesumbacterium proteus, которая накапливается в виде рекомбинантного продукта в цитозоле экстремофила Yarrowia lipolytica.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Мария Данилова, Екатерина Эпова, Елена Трубникова, Нияз Бадрутдинов, Анастасия Кокорева, Максим Пусев, Юлия Дерябина и Елена Исакова Encapsulated Phytase Produced by Recombinant Yarrowia lipolytica Exhibits High Efficiency on Broiler Chickens in Low Dosage Applied Sciences, том 12 № 23, 11999 (год публикации - 2022)
10.3390/app122311999

2. Исакова Е.П., Гесслер Н.Н., Дерябина Ю.И. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ФИТАЗЫ В ШТАММАХ YARROWIA LIPOLYTICA, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНОМ НЕЙТРОФИЛЬНОЙ ФИТАЗЫ ИЗ OBESUMBACTERIUM PROTEUS, В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ ПЕРИОДИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, том 58 № 10 (год публикации - 2022)

Публикации

1. Светлана Юрьевна Филиппович, Елена Павловна Исакова, Наталья Николаевна Гесслер, Юлия Ивановна Дерябина Advances in immobilization of phytases and their application Bioresource Technology, 379, 129030 (год публикации - 2023)
10.1016/j.biortech.2023.129030

2. Гесслер Н.Н., Кокорева А.С., Дерябина Ю.И., Исакова Е.П. Optimization of Cultivation Conditions of Yarrowia lipolytica Po1f pUV3-Op Transformant to Get the Encapsulated Phytase as The Feed Supplement ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, Vol. 59, No. 6, pp. 909–918. (год публикации - 2023)
10.1134/S0003683823330013

3. Е.А. Овсейчик, Кляйн О.И., Н.Н. Гесслер, Ю.И. Дерябина, Е.П. Исакова ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНКАПСУЛИРОВАННОЙ ФИТАЗЫ НА ОСНОВЕ YARROWIA LIPOLYTICA C ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Актуальная биотехнология, №1, с. 5-6 (год публикации - 2023)
10.20914/2304-4691-2023-1-5-6

4. Екатерина А. Овсейчик, Ольга И.Кляйн, Наталья Н. Гесслер, Юлия И. Дерябина, Елена П. Исакова Encapsulated Phytase Produced by Recombinant Yarrowia lipolytica Exhibits High Efficiency on Quails at Low Doses Preprints, Preprints, 2023081242. (год публикации - 2023)
10.20944/preprints202308.1242.v1

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе реализации проекта по итогам 3-его года (2024) были получены следующие результаты: 1. Разработана методика ферментации отходов бойни с использованием нового рекомбинантного штамма-продуцента микроинкапсулированной фитазы Bacillus subtilis Yarrowia lipolytica (pUV3 – Phy-BS), которая включает следующие стадии: 1) Получение гомогената костного остатка, внутренностей и кожи, образующихся при забое и механической обвалке тушек бройлеров в условиях промышленной птицефабрики (с использованием механического блендера). 2) Оптимизация состава среды культивирования штамма Y. lipolytica (pUV3 – Phy-BS) с учетом рекомендаций, полученных при анализе полного факторного эксперимента, проведенного на 1 этапе реализации проекта. 3)Проведение ферментации с использованием оптимизированного состава среды культивирования. Таким образом, были оптимизированы состав культуральной среды для ферментации трансформанта Y. lipolytica (pUV3 – Phy-BS), позволяющий значительно увеличить фитазную активность и обеспечить получение кормовой добавки с максимальным содержанием целевой активности фитазы класса PhyD. Также разработанная методика позволяет использовать в качестве субстрата отходы боен и производств масло-жировой промышленности, что обеспечивает биоремедиацию промышленных отходов и стоков. 2 Разработаны рекомендации по применению микроинкапсулированных фитаз B. subtilis и O.proteus в виде монопрепаратов и в виде комплексной добавки при кормлении перепелов различного возраста мясо-яичной породы «Маньчжурские золотистые» и цыплят-бройлеров нового отечественного кросса «Смена 9»: 1) Использовать микроинкапсулированные фитазы B. subtilis и O.proteus в виде монопрепаратов с первой недели жизни птицы. 2) Не ограничивать доступ животных к воде. 3) Использовать фитат-содержащие корма растительного происхождения (соевый шрот, пшеница, кукуруза, жмых подсолнечный, соя полножирная, масло подсолнечное, соль, премикс) без добавления животных компонентов. 4) Использовать добавку в дозах, показавших лучший результат по данной породе птицы (500 FYT/кг корма), не превышающих по объему 0,6-1,2%. 5) Использовать корм с содержанием фосфора 0,8% (0,45% доступного фосфора). 3. Выполнена оценка абсолютной эффективности коммерчески доступных водорастворимых фитаз и инкапсулированных фитаз B. subtilis и O.proteus в качестве средства перевода органического фосфора зернового комбикорма в доступную для усвоения животными форму. Анализ влияния микроинкапсуляции фитазы O.proteus, используемой в виде кормовой добавки, на содержание остаточного фосфора в фекалиях перепелов по сравнению с использованием водорастворимых фитаз классов PhyA и PhyC показал, что содержание остаточного фосфора в группах, получающих фитазу O.proteus на фоне разного содержания фосфора, на 28 день эксперимента уменьшалось по отношению к контрольной группе на 10% и 7%, соответственно. Результаты эксперимента по дозовой зависимости остаточного содержания фосфора в фекалиях цыплят-бройлеров от уровня микроинкапсулированной фитазы показали, что содержание остаточного фосфора в группе 4 на 35 день эксперимента уменьшалось по отношению к контрольной группе 1 (0,45% доступного Р) на 18%, в то время как в группе 5, получающей Ладозим Прокси, этот показатель снижался на 13,3%. 4. Создана технология производства бактериальной фитазы класса PhyD из B. subtilis, основанная на уникальном принципе микроинкапсуляции, ранее примененном только на одном примере – фитазе из O.proteus. Разработанная технологическая схема содержит следующие этапы. 1) Идентификация генов, кодирующих фитазы класса PhyD из B. subtilis. 2) Получение интегративных генетических конструкций, содержащих ген фитазы, с использованием промотора VDAC. 3) Отбор трансформантов Y. lipolytica PO1f, несущих интегрированную конструкцию, экспрессирующую фитазу. 4) Наработка биомассы отобранных трансформантов Y. lipolytica PO1F (pUV3-PhyD-B.S.-v1), синтезирующих внутриклеточную бактериальную фитазу класса PhyD из B. subtilis, для создания кормовых премиксов. Таким образом, в ходе реализации проекта впервые была использована технология производства фитаз класса PhyC из энтеробактерии O. proteus и PhyD из B. subtilis, которые способны накапливаться в виде рекомбинантных продуктов в цитозоле экстремофильного штамма дрожжей Y. lipolytica. Полученные в ходе проведения технологической схемы кормовые добавки показали высокую эффективность при испытаниях на перепелах и цыплятах-бройлерах.

Публикации

1. ИСАКОВА Е.П., ОВСЕЙЧИК Е.А., ГЕССЛЕР Н.Н., КЛЯЙН О.И., РОЗУМИЙ А.В., ДЕРЯБИНА Ю.И., ЛУКАШЕНКО В.С. ВЛИЯНИЕ КОРМОВЫХ ДОБАВОК С СОДЕРЖАНИЕМ ФИТАЗ ГРИБНОГО И БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЯПОНСКИХ ПЕРЕПЕЛОВ (COTURNIX JAPONICA) Сельскохозяйственная биология (год публикации - 2024)

2. Екатерина А. Овсейчик, Ольга И. Кляйн, Наталья Н. Гесслер, Юлия И. Дерябина, Валерий С. Лукашенко и Елена П. Исакова The Efficacy of Encapsulated Phytase Based on Recombinant Yarrowia lipolytica on Quails’ Zootechnic Features and Phosphorus Assimilation VETERINARY SCIENCES, Vet. Sci. 2024, 11, 91. https://doi.org/10.3390/vetsci11020091 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3390/vetsci11020091

Возможность практического использования результатов
Использование ферментов в производстве кормов для животноводства во всем мире рассматривается как незаменимый технологический инструмент, позволяющий максимально эффективно использовать доступное фуражное сырье, повышать привесы, сокращать затраты на минеральные добавки. Фитазы (эстеразы, гидролизующие 1,2,3,4,5,6-гексафосфат миоинозитола) являются одним из наиболее востребованных типов ферментов кормового назначения. Это обусловлено тем, что более 65% фосфора, содержащегося в зерне злаков, и около 30% - в соевых бобах приходится на долю фитата, который не поддается гидролизу в желудочно-кишечном тракте свиней, птицы, рыбы и других продуктивных животных. В ходе реализации проекта предложена не имеющая аналогов технология производства фитазы класса PhyС из энтеробактерии Obesumbacteium proteus. Она заключается в отказе от производства фермента в секреторной форме: рекомбинантный продукт накапливается в цитоплазме рекомбинантных клеток экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica. Такой продуцент имеет целый ряд технологических преимуществ. Главными из них являются: (1) возможность использования продуцента фитазы для биоремедиации отходов и стоков боен и маслоэкстрационного производства с образованием комбинированной белково-ферментной кормовой добавки – при этом происходит очистка отходов и стоков от гидропероксидов и ксенобиотиков, исчезает необходимость отделять биомассу от растворимой фазы среды, что существенно сокращает расходы на сепарацию и сушку ферментной добавки, сводит к нулю образование отходов биотехнологического производства; (2) за счёт микроинкапусляции в клетках дрожжей-продуцентов существенно возрастает термостабильность фитазы по сравнению с внеклеточной формой, что улучшает её совместимость с технологией распылительной сушки премиксов; (3) за счёт микроинкапсуляции на порядок и более сокращаются непроизводительные потери фермента за счёт кислотной денатурации и протеолиза при прохождении желудка скота и птицы.