Оптимизация биолюминесцентной системы грибов для прикладных биоаналитических и биоимиджинговых технологий

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-44-02024

НазваниеОптимизация биолюминесцентной системы грибов для прикладных биоаналитических и биоимиджинговых технологий

Руководитель Ямпольский Илья Викторович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №63 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (DST)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова Биолюминесцентные грибы, люцифераза, химия биолюминесценции, люциферин, молекулярная визуализация

Код ГРНТИ34.17.09

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Биолюминесценция — способность живых организмов излучать свет в видимом диапазоне. В ее основе лежит биохимическая реакция окисления субстрата люциферина кислородом под действием фермента люциферазы, сопровождающаяся испусканием света. Из примерно 40 известных биолюминесцентных систем только для нескольких из них были установлены структура люциферина и ген катализирующей его окисление люциферазы. Несмотря на небольшое число описанных люциферин-люциферазных пар (около 10), они были усовершенствованы и использованы для создания большого разнообразия люминесцентных инструментов для различных биомедицинских приложений (Shimomura and Yampolsky 2019). Так, одними из самых широко используемых являются люциферазы светлячка FLuc (Wood et al. 1984), Renilla RLuc (Cormier and Karkhanis 1971) и NanoLuc (Hall et al. 2012) ввиду их яркости и доступности вариантов этих систем разных цветов (Kaskova, Tsarkova, and Yampolsky 2016). Однако одним из недостатков использования данных люциферин-люциферазных пар является необходимость экзогенного добавления субстрата, что приводит к инвазивности проводимых исследований. Ранее в нашей лаборатории были изучены механизмы биолюминесценции высших грибов: установлены структуры люциферина грибов и его интермедиатов, а также ферменты, участвующие в их конверсии (Konstantin V. Purtov et al. 2015; Kaskova et al. 2017; Kotlobay et al. 2018). Данная биолюминесцентная система избавляет от экзогенного добавления субстрата и открывает новые возможности для проведения неинвазивного биоимиджинга in vivo в эукариотических организмах (Mitiouchkina et al. 2020). Однако несмотря на то, что биолюминесцентная система грибов является генетически кодируемой, испускаемый в результате реакции свет по яркости уступает другим широко используемым люциферин-люциферазным системам — светлячка, NanoLuc, Renilla (данные не опубликованы). Помимо этого, до сих пор отсутствуют варианты люциферин-люциферазной системы грибов разных цветов, которые можно было бы использовать для многоцветного люминесцентного биоимиджинга (Suzuki et al. 2016). Для создания более совершенных биолюминесцентных репортеров, пригодных для решения широкого ряда биотехнологических задач, необходима оптимизация биолюминесцентной системы грибов путем улучшения спектральных характеристик как субстрата (люциферина), так и фермента (люциферазы). Настоящий проект нацелен на оптимизацию люциферин-люциферазной системы грибов путем получения аналогов люциферина с улучшенными спектральными характеристиками, а также проведения направленной эволюции люциферазы гриба Neonothopanus nambi. Также мы планируем протестировать люциферазы из других светящихся грибов на возможность окислять люциферин грибов и его синтезированные в ходе проекта аналоги. Помимо этого, мы протестируем аналоги кофейной кислоты на возможность их использования ферментами биолюминесцентной системы грибов. Совместно с научной группой Абхиджита Де мы планируем показать эффективность улучшенной в ходе проекта люциферин-люциферазной системы грибов путем разработки биолюминесцентных инструментов для проведения имиджинга в культуре опухолевых клеток, исследования взаимодействия белков путем создания сенсоров, основанных на биолюминесцентном резонансном переносе энергии (bioluminescence resonance energy transfer, BRET), и проведения предклинических имиджинговых исследований in vivo.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сильвестрова А., Палкина К., Андрианова А., Ямпольский И., Каськова З. Synthesis of plant and fungal secondary metabolites - substrates for the biosynthesis of fungal luciferin analogues in vivo FEBS Open Bio, 12(Suppl.1), 326 (год публикации - 2022)
10.1002/2211-5463.13440

2. Корунова Е.С., Гороховатский А.Ю., Барыкин А.Д., Шахова Е.С., Чепурных Т.В., Ямпольский И.В. The thermostability of fungal luciferases FEBS Open Bio, 12(Suppl.1), 239 (год публикации - 2022)
10.1002/2211-5463.13440

3. Шахова Е.С., Каратаева Т.А., Маркина Н.М., Митюшкина Т.Ю., Палкина К.А., Wood M.G., Hoang T.T., Hall M.P., Фахранурова Л.И., Перфилов М.М., Блохина А.Е., Малышевская А.К., Горбачев Д.А., Бугаева Е.Н., Плетнева Л.К., Бабенко В.В., и др. An improved pathway for autonomous bioluminescence imaging in eukaryotes Nature Methods (год публикации - 2024)

4. Палкина К.А., Балакирева А.В., Белозерова О.А., Чепурных Т.В., Маркина Н.М., Ковальчук С.И., Царькова А.С., Мишин А.С., Ямпольский И.В., Саркисян К.С. Domain Truncation in Hispidin Synthase Orthologs from Non-Bioluminescent Fungi Does Not Lead to Hispidin Biosynthesis International Journal of Molecular Sciences, 24(2), 1317 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24021317

5. Mujawar A., Phadte P., Палкина К.А., Маркина Н. М., Mohammad A., Thakur B.L., Саркисян К.С., Балакирева А.В., Ray P., Ямпольский И.В. Triple Reporter Assay: A Non-Overlapping Luciferase Assay for the Measurement of Complex Macromolecular Regulation in Cancer Cells Using a New Mushroom Luciferase–Luciferin Pair Sensors, 23(17), 7313 (год публикации - 2023)
10.3390/s23177313

6. Муджавар А., Димри С., Палкина К. А., Маркина Н. М., Саркисян К. С., Балакирева А. В., Ямпольский И. В., Де А. Novel BRET combination for detection of rapamycin-induced protein dimerization using luciferase from fungus Neonothopanus nambi Heliyon, 10 (4), e25553 (год публикации - 2024)
10.1016/j.heliyon.2024.e25553

7. Стевани К.В., Замунер К.К., Бастос Е.Л., де Нобрега Б.Б., Соарес Д.М.М., Оливейра А.Г., Шахова Э.С., Саркисян К.С., Ямпольский И.В., Каскова З.М. The living light from fungi Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews, 58, 100654 (год публикации - 2024)
10.1016/j.jphotochemrev.2024.100654

8. Барыкин А.Д., Чепурных Т.В. , Осипова З.М. Глубокое обучение в моделировании белок-лигандного взаимодействия: новые пути в разработке лекарственных препаратов Вестник РГМУ, 1, 50-54 (год публикации - 2024)
10.24075/brsmu.2024.002

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках проекта «Оптимизация биолюминесцентной системы грибов для прикладных биоаналитических и биоимиджинговых технологий» в отчетном году достигнуты значимые научные результаты, способствующие развитию методов биолюминесценции для фундаментальных и прикладных исследований. 1. Изучение свойств аналогов люциферина Было проведено исследование ингибиторных свойств синтезированных аналогов люциферина грибов. Установлено, что все изученные соединения проявляют свойства обратимых конкурентных ингибиторов. Определены константы ингибирования для ряда перспективных аналогов, что позволяет прогнозировать их поведение в биолюминесцентных реакциях. Результаты показывают, что определенные аналоги могут быть использованы для регулирования активности люциферин-люциферазных систем. 2. Определение кинетических характеристик и спектров биолюминесценции Проведено изучение взаимодействия синтетических аналогов люциферина с биолюминесцентными ферментами грибов, включая константы Михаэлиса и спектры излучения. Полученные данные подтвердили высокую специфичность и эффективность ряда комбинаций аналогов с люциферазами. Это открывает возможности для разработки новых репортерных систем с улучшенными характеристиками. 3. Разработка и синтез новых соединений За отчетный период было синтезировано несколько новых аналогов гиспидина, которые проявили биолюминесцентную активность при тестировании. В ходе работы были усовершенствованы методики синтеза, что позволило повысить выход целевых соединений и их химическую стабильность. 4. Гетерологичная экспрессия ферментов биолюминесцентной системы Разработаны и протестированы конструкции для экспрессии ключевых ферментов биолюминесцентной системы в клетках дрожжей Pichia pastoris. Полученные трансформанты использовались для анализа взаимодействия ферментов с синтетическими аналогами люциферина. Установлено, что определенные комбинации люцифераз и гиспидин-3-гидроксилаз демонстрируют значительно более высокий уровень биолюминесцентной активности по сравнению с природными системами. 5. Функциональное тестирование в клетках млекопитающих Созданы и протестированы генно-инженерные конструкции для экспрессии биолюминесцентных ферментов в клеточной линии HEK293T. Результаты подтвердили возможность использования разработанных систем в клеточных моделях млекопитающих, что расширяет спектр их потенциального применения в биомедицинских исследованиях. 6. Исследование стабильности аналогов люциферина Было проведено исследование устойчивости синтетических аналогов люциферина к физиологическим условиям. Выявлено, что несколько новых соединений сохраняют стабильность и активность значительно дольше, чем природные аналоги, что делает их перспективными для долгосрочных исследований. 7. Адаптация систем для прикладных задач Достигнутые результаты продемонстрировали возможность создания универсальных биолюминесцентных систем, подходящих для неинвазивной визуализации процессов in vivo, мультиплексных исследований, а также для диагностики и мониторинга заболеваний. Это открывает перспективы для применения разработанных технологий в биомедицине и агробиологии. Результаты проекта подтверждают высокий научный уровень исследований и соответствуют актуальным задачам в области биотехнологий, биомедицины и синтетической биологии. Работа над проектом позволила получить данные, которые могут быть использованы в прикладных исследованиях и внедрении биолюминесцентных технологий в практику.

Публикации

Возможность практического использования результатов
–