Изучение генетического потенциала видов Quercus и Betula для использования в селекции на устойчивость к засухе и дефициту азота

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-64-00036

НазваниеИзучение генетического потенциала видов Quercus и Betula для использования в селекции на устойчивость к засухе и дефициту азота

Руководитель Шестибратов Константин Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №75 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые слова Береза, дуб, глобальное изменение климата, засухоустойчивость, дефицит азота, географические культуры, дендрохронология, молекулярные маркеры, омикс-технологии, взаимодействие генотип-среда

Код ГРНТИ34.23.57

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Глобальное изменение климата оказывает значительное влияние на такую метеозависимую отрасль, как лесное хозяйство. Особенно это важно для России, где температура воздуха растет в 2,5 раза быстрее, чем в среднем по миру. В связи с этим для лесных древесных пород признак засухоустойчивости приобретает особое значение. Другим важным фактором является доступность азота, лимитирующая роль которого для деревьев возрастает с увеличением концентрации СО2 в атмосфере. Виды деревьев из родов Quercus и Betula являются очень важными хозяйственно-ценными породами в лесном хозяйстве России. Дуб является основной лесообразующей породой в лесостепной и степной зонах и дубравы имеют высокую природоохранную значимость. Береза является основной лиственной породой страны и перспективна для плантационного лесовыращивания. Обе эти породы оказались чувствительными к изменению климата, приводящему к усыханию березовых и деградации дубовых насаждений. Особенную актуальность эта проблема приобретает на южной границе распространения лесов, где они наиболее уязвимы к недостатку влаги – в лесостепной зоне. Научная проблема понимания механизмов устойчивости древесных растений к абиотическим стрессам является особенно актуальной в условиях изменения климата. Комплексный подход к ее решению, включающий использование, наряду с традиционными методами исследований, также и омикс-технологий, позволит лучше понять молекулярно-генетические и физиолого-биохимические механизмы адаптации деревьев к меняющимся условиям окружающей среды, на которые они вынуждены реагировать в течение многих лет своей жизни. Изучению генетики и селекции дуба, несмотря на всю важность этой породы, в России уделяется заметно меньше внимания по сравнению с другими лиственными видами. В частности, для дуба (как и для березы) до сих пор не зарегистрировано ни одного сорта, в отличие от других лесных культур – тополя, сосны, ели. Это также подтверждает актуальность усиления селекционной работы с данными породами. Основной целью проекта является изучение механизмов устойчивости к дефициту воды и азота у древесных растений на примере ценных, но малоизученных видов - дуба и березы, для последующего использования в селекции на устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды. В этом проекте тесно связаны две научные дисциплины: с одной стороны, генетика является теоретической основой селекции, с другой – генетикам для исследований требуется растительный материал, полученный селекционерами. Уникальный селекционный материал дуба и березы будет оценен на засухоустойчивость методом дендрохронологического анализа древесины и генотипирован с помощью SSR маркеров. Отобранные контрастные генотипы будут использованы для изучения устойчивости к дефициту воды и азота в ряде экспериментов: 1) по прорастанию желудей дуба в условиях обезвоживания, 2) в тепличных исследованиях, 3) в двухлетних полевых экспериментах, проводимых параллельно в почвенно-климатических условиях лесостепной (Воронежская область) и лесной (Московская область) зон. Научная новизна проекта заключается в комплексной оценке устойчивости растений дуба и березы с использованием как методов физиологии и биохимии растений, так и анализов генома, транскриптома, протеома и метаболома. Исследования на видах Q. robur, Q. rubra, B. pendula и B. pubescens впервые позволят изучить особенности молекулярно-генетических механизмов устойчивости к засухе и дефициту азота у представителей семейств Буковые (Fagaceae) и Березовые (Betulaceae), а в пределах родов – между видами, занимающими различные экологические ниши (Betula) или имеющих различное географическое происхождение (Quercus). Это, несомненно, улучшит наше понимание эволюции механизмов устойчивости к абиотическим факторам у древесных растений. Полевые эксперименты в различных регионах позволят оценить взаимодействие генов и окружающей среды. Наконец, впервые на деревьях будет подробно изучена реакция на одновременное воздействие двух абиотических стрессов – недостатка воды и дефицита азота.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ромашкина И.В., Тихомирова Т.С., Шестибратов К.А. АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ УСТОЙЧИВОСТИ БЕРЕЗЫ И ДУБА К ДЕФИЦИТУ ВОДЫ И АЗОТА Известия Санкт-Петербургской лесотехнической академии (год публикации - 2022)

2. Попова А.А., Евлаков П.М., Молчанов В.В., Шестибратов К.А. Результаты исследования географических культур дуба черешчатого в Воронежской области Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства (год публикации - 2022)

3. Миленин А.И., Попова А.А., Шестибратов К.А. Effect of Type of Forest Growth Conditions and Climate Ele-ments on the Dynamics of Radial Growth in English Oak (Quercus robur L.) of Early and Late Phenological Forms Forests (год публикации - 2022)

4. Тихомирова Т.С., Крутовский К.В., Шестибратов К.А. Molecular Traits for Adaptation to Drought and Salt Stress in Birch, Oak and Poplar Species Forests, V. 14, N. 1, 7. (год публикации - 2023)
10.3390/f14010007

5. Лебедев В.Г., Коробова А.В., Шендель Г.В., Шестибратов К.А. Hormonal status of transgenic birch with a pine glutamine synthetase gene during rooting in vitro and budburst outdoors Biomolecules, V. 13, N. 12, 1734. (год публикации - 2023)
10.3390/biom13121734

6. Румянцева А.В., Чекрыгин С.А., Видягина Е.О. Interrelation of the Radial Increment of Trees with Various Factors Physiologia, V. 3, N. 2, 347-365. (год публикации - 2023)
10.3390/physiologia3020024

7. Карунас A.С., Лебедев В.Г., Селиванова Е.В., Ромашкина И.В., Шестибратов К.А. Влияние водного стресса и дефицита азота на рост различных генотипов березы пушистой и березы повислой Труды СПбНИИЛХ (год публикации - 2023)

8. Евлаков П.М., Попова А.А., Рыжкова В.С., Шестибратов К.А., Лебедев В.Г. Влияние засухи на фотосинтетические особенности, устьичную проводимость и эффективность использования воды у ювенильных растений дуба черешчатого (Quercus robur L.) Труды СПбНИИЛХ (год публикации - 2023)

9. Ромашкина И.В., Селиванова Е.В., Попова А.А., Лебедев В.Г., Шестибратов К.А. Эффективность выделения ДНК из органов и тканей дуба черешчатого (Quercus robur L.) и березы повислой (Betula pendula Roth) различными методами Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства, № 4 (год публикации - 2024)

10. Лебедев В.Г. Metabolic Profile of Transgenic Birch Plants with the Conifer Cytosolic Glutamine Synthetase Gene GS1 Russian Journal of Bioorganic Chemistry, V. 50, N. 6, P. 2596-2610 (год публикации - 2024)
10.1134/S1068162024060207

11. Исаков И.Ю., Шестибратов К.А. Фенотипическая пластичность и селекционно-репродуктивные особенности биоресурсной коллекции рода Betula L. в Воронежской области Известия Санкт-Петербургской лесотехнической академии, выпуск 252 (год публикации - 2025)

12. Литовченко Д.А., Попова А.А., Шестибратов К.А., Крутовский К.В. Climate Response and Radial Growth Dynamics of Pedunculate Oak (Quercus robur L.) Plus Trees and Their Half-Sib Progeny in Periods of Severe Droughts in the Forest-Steppe Zone of Eastern Europe Plants, V.13 (22) : 3213 (год публикации - 2024)
10.3390/ plants13223213

13. Исаков И.Ю., Шестибратов К.А. Феногенетический анализ стабильности развития вегетативных органов берёзы повислой и березы пушистой Лесотехнический журнал, Лесотехнический журнал. – 2025. – Т. 14. – № 4 (год публикации - 2025)

14. ИЗМЕНЕНИЯ В ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО К ЗАСУХЕ ГЕНОТИПА QUERCUS ROBUR ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СТРЕССА ДЕФИЦИТА ВЛАГИ ИЗМЕНЕНИЯ В ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО К ЗАСУХЕ ГЕНОТИПА QUERCUS ROBUR ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СТРЕССА ДЕФИЦИТА ВЛАГИ Лесотехнический журнал (год публикации - 2025)

15. Влияние засухи на интенсивность видимого фотосинтеза и водный режим ювенильных растений генотипов дуба черешчатого и березы повислой и березы пушистой в контролируемых условиях открытого грунта Влияние засухи на интенсивность видимого фотосинтеза и водный режим ювенильных растений генотипов дуба черешчатого и березы повислой и березы пушистой в контролируемых условиях открытого грунта Лесотехнический журнал (год публикации - 2025)

16. ВЛИЯНИЕ ДЕФИЦИТА ВЛАГИ НА ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ЗАСУХОУСТОЙЧИВОГО ГЕНОТИПА QUERCUS ROBUR L. ВЛИЯНИЕ ДЕФИЦИТА ВЛАГИ НА ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ЗАСУХОУСТОЙЧИВОГО ГЕНОТИПА QUERCUS ROBUR L. Труда Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства (год публикации - 2025)

17. Способность к гибридизации и гибридный потенциал в роде Берёза в Центральной лесостепи России Способность к гибридизации и гибридный потенциал в роде Берёза в Центральной лесостепи России Труда Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства (год публикации - 2025)

18. Тихомирова Т.С., Лебедев В.Г., Видягина Е.О., Попова А.А., Евлаков П.М., Гродецкая Т.А., Нартова И.М., Рыжкова В.С., Шестибратов К.А. Comparative Transcriptome Analysis of Two Related but Contrasting Quercus robur Genotypes under Drought Stress Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2025, Vol. 51, No. 6, pp. 2831–2851 (год публикации - 2025)
10.1134/S1068162025604513

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведена гибридизация контрастных форм березы на объекте второй генерации, Семилукском лесопитомнике. По итогам гибридизации собраны лоты гибридных семян. По каждой гибридной комбинации в лоте количество семян варьировало в среднем от 200 до 500. Всхожесть семян на данном этапе не оценивали. Проведены также прививки растений дуба. В эксперименте с прививками использовали генотипы 149/1, 405/60, (группа условно не устойчивых) 151/1, 11/61 (группы условно устойчивых). Приживаемость прививок зеленым черенком составила в среднем 45-50%, тогда как одревесневшим черенком 58-65%. Всего получено 212 привитых растений (на каждый генотип более 50 растений). Заложен и проведен первый год эксперимента в условиях открытого грунта под дождезащитными укрытиями в двух локациях – в г. Пущино Московской области и в г.Воронеж. Показано, что у растений берёзы, испытывающих засуху, максимальная интенсивность видимого фотосинтеза варьировала от 9.2 до 17.1 мкмоль/м2/с . Самый высокий показатель был зафиксирован у генотипа берёзы повислой ББ4б (17.1±1.28 мкмоль/м2/с), самый низкий – у генотипа берёзы пушистой F14GS8b (9.2±1.25 мкмоль/м2/с). У генотипов березы интенсивность видимого фотосинтеза при воздействии засухи снизилась в среднем на 35-39%, интенсивность транспирации на 42-51%, устьичной проводимости на 49-52%. Выявлено, что интенсивность транспирации листьев у растений березы в условиях засухи варьировала от 2,1 до 3,2 ммоль Н2О/м2/с (в группе Воронежского эксперимента) и от 1,9 до 3,1 ммоль Н2О/м2/с (в группе Московского эксперимента). У растений в оптимальных условиях – от 2.5 до 3.6 ммоль Н2О/м2/с (в группе Воронежского эксперимента) и от 2,1 до 3.4 ммоль Н2О/м2/с (в группе Московского эксперимента). Выявлено, что значения интенсивности транспирации листьев у растений берёзы, например у генотипа F14GS8b в условиях засухи составили 2,9±0.21 ммоль Н2О/м2/с (группа Воронежского эксперимента), у генотипа бп4а 3.2 ммоль Н2О/м2/с (группа растений Воронежского эксперимента). Значения ниже средних имели генотипы берёзы пушистой БП3F1 и БП4а. Между вариантами проведения экспериментов в двух георграфических локациях наблюдались незначительные различия, что может быть связано в погодными условиями. В среднем в регионе экспериментальной площадки размещенной в Воронеже среднемесячные температуры летних месяцев были выше таковых в Московской области в районе г.Пущино на 2-3 градуса. Так, среднемесячные температуры в районе г. Пущино составляли в июне 19,6, июле 21,7, августе 18,6 С, тогда как в г.Воронеж составляли в июне 21,9, июле 25,8, августе 22,1 С. Показано, что основные параметры фотосинтеза при воздействии засухи снижались у большей части контрастных форм дуба. Максимальная интенсивность фотосинтеза листьев варьировала от 9.3 до 16.8 мкмоль/м2/с на экспериментальной площадке в Воронежксой области, и от 8.8.до 15.3 мкмоль/м2/с на растениях экспериментальной площадки в Московской области. В группе Воронежского эксперимента наибольшая величина интенсивности фотосинтеза отмечалась у растений, принадлежащих к генотипу 233/57 (16.8 мкмоль/м2/с), а наименьшая – у растений генотипа 151/1 (9.3 мкмоль/м2/с). В группе Московского эксперимента наибольшая величина интенсивности фотосинтеза отмечалась у растений, принадлежащих к генотипу 63/12 (15,3 мкмоль/м2/с), а наименьшая также у растений генотипа 151/1 (8,8 мкмоль/м2/с). Показано, что некоторые генотипы проявляют относительную устойчивость к стрессу, характеризуясь меньшим снижением фотосинтетической активности - 233/57, 339/57. И наоборот, также выявлены генотипы , демонстрирующие значительное снижение устьичной проводимости и фотосинтетической активности в условиях стресса - 63/12 продемонстрировал снижение интенсивности фотосинтеза на 34.4%, устьичная проводимость при этом уменьшилась на 57.1%. В аналогичных условиях генотип 151/1 показал снижение фотосинтетической активности на 37.6%, сопровождающееся уменьшением устьичной проводимости на 46.6%. В целом по двум экспериментальным группам при действии стрессовых факторов (засухи) интенсивность видимого фотосинтеза снизилась в среднем на 30-35%, интенсивность транспирации на 45-50%, устьичной проводимости на 52-55%. Проведены анализы транскрипции генов методом ПЦР в реальном времени с использованием праймеров на 20 и 15 перспективных генов для дуба и березы соответственно, предположительно ассоциированных с засухоустойчивостью. Анализ показал, что экспрессия гена каталазы, например у устойчивых линий дуба после периода засухи повышалась в сильнее (в 3,5-4 раза), чем у неустойчивых линий (с 2,5-2,9раз). В препаратах РНК березы анализ экспрессии гена каталазы позволил выявить более высокую экспрессию каталазы у генотипов бб31 и бб4б (в 3-3.5 раза), тогда как у генотипов бп4а, бп3ф1 и F14 GS 8b, экспрессия каталазы повышалась при воздействии засухи на 2,5-3,2 раза. Показано, что экспрессия генов данной группы - GST-23 подобной глутатион трансферазы, субъединица 9 АТФ синтаза, малый белок теплового шока, экспанзин А-8, аквапорин PIP1-2, генах бетта амилаза 7, зеаксантин эпоксидаза, пролиндегидрогеназа - в условиях стресса засухи повышалась в среднем в 2,5-3 раза. Достоверные отличия повышения экспрессии остальных генов изучаемой группы не выявлено. Проведено генотипирование контрастных генотипов дуба и березы методом RADseq секвенирования. Из ранее разработанных потенциальных SNP маркеров скрининг по результатам секвенирования проведен по всем 336 SNP в генах-кандидатах Q. Robur b 224 SNP березы. Результаты показали, что 336 потенциальных маркеров одновременно не встречаются ни в одном из 11 анализируемых генотипов контрастных форм дуба. 32 ранее разработанных SNP маркера не были выявлены ни в одной форме. В тоже время 65 SNP маркера обнаружены во всех изучаемых формах. Можно сделать предположение, что данные маркеры не могут считаться перспективными для генотипирования на предмет устойчивости к засухе, их ассоциированность с данным признаком в экспериментальных условиях проекта не подтвердилась. Показано, что оставшиеся 239 из исходных 336 маркеров демонстрировали достаточно высокий уровень полиморфизма. Было показано, что 224 потенциальных маркеров одновременно также не встречаются ни в одном из 8 анализрируемых генотипов контрастных форм березы. 28 ранее разработанных SNP маркера не были выявлены ни в одной форме. В тоже время 89 SNP маркеров обнаружены во всех изучаемых формах. Оставшиеся 107 из исходных 224 маркеров демонстрировали достаточно высокий уровень полиморфизма. Идентифицированы генетические локусы, связанные с адаптацией древесных растений к недостатку воды и азота (среди которые можно привести локусы, локализованные в генах GST-23 подобной глутатион трансферазы, субъединица 9 АТФ синтаза, малый белок теплового шока, экспанзин А-8, аквапорин PIP1-2, генах бетта амилаза 7, зеаксантин эпоксидаза, пролиндегидрогеназа и ряд других).

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Получены результаты и подведены итоги проведения второго года двухлетнего эксперимента по оценке растений березы и дуба на устойчивость к засухе и недостатку азота в условиях открытого грунта (контейнерная культура) с использованием дождезащитных укрытий (rainout shelters). В течение двух лет изучали устойчивость березы и дуба к засухе и дефициту азота в контейнерной культуре под дождезащитными укрытиями. У контрольных растений дуба прирост высоты составил 25,3%, диаметра – 20,5%, у березы – 35,8% и 18,1% соответственно. На второй год прирост дуба: высота – 15%, диаметр – 10%, березы: высота – 25%, диаметр – 13%. Генотипы дуба 339/57 и 543/60 показали наименьшее снижение роста при дефиците азота, у березы засуха сильнее повлияла на генотипы бп3ф1 и бп4а. Семьи дуба 63.12 и 339.57 демонстрировали высокую фотосинтетическую активность в контроле, а 339.57 – устойчивость к неблагоприятным условиям У дуба транспирация в условиях засухи варьировала от 1.1 до 2.7 ммоль Н2О/м2/с в зависимости от места эксперимента, в контроле – выше. Дефицит азота снижал концентрацию хлорофилла у березы. У дуба засуха не влияла на содержание хлорофилла и каротиноидов, за исключением популяций 151/1 и 23/52, дефицит азота отрицательно влиял на популяции 23/12 и 303/32. Транспирация березы в условиях засухи: 2,0-3,6 ммоль Н2О/м2/с, в контроле – выше. Дуб использует пероксидазо-ориентированный тип антиоксидантной защиты, береза – каталазный. Получены результаты и подведены итоги проведения эксперимента по оценке привитых растений контрастных генотипов дуба на устойчивость к засухе и недостатку азота в условиях открытого грунта (контейнерная культура) с использованием дождезащитных укрытий (rainout shelters). В 2025 году проведен эксперимент по оценке устойчивости привитых и непривитых растений дуба контрастных генотипов к засухе и недостатку азота. Из 212 привитых растений после зимовки выжило 205, у 7 погибла привитая часть. Генотип 405.60 в 2025 году показал интенсивную активацию гена SOD у непривитых растений, в то время как привитые растения воспроизвели результаты прошлого года. У непривитых растений семейства 151.1 при засухе наблюдалось снижение содержания хлорофилла и каротиноидов, а у привитых – снижение фотосинтеза на 15,2% и устьичной проводимости на 32,5%. Ранее семья 151.1 была отнесена к группе условно устойчивых. Растения семьи 11/61 показали стабильные результаты: уровень хлорофиллов и каротиноидов оставался на уровне контроля при дефиците азота и при комплексном воздействии засухи и дефицита азота. Получены результаты и подведены итоги проведения эксперимента по оценке гибридных растений березы на устойчивость к засухе и недостатку азота в условиях теплицы. Эксперимент оценил устойчивость гибридных берез к засухе и недостатку азота в теплице. Гибриды березы повислой показали более высокое содержание хлорофилла, чем береза пушистая. Дефицит азота снижал содержание хлорофилла во всех группах. Умеренная засуха сильнее повлияла на высоту березы пушистой, чем повислой, и не влияла на высоту в условиях недостатка азота. Засуха значительно повысила активность антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы), а дефицит азота - нет. Устойчивые к засухе гибриды демонстрировали более высокую активность этих ферментов. Протеомный анализ выявил больше стресс-ассоциированных белков в опытных (с засухой) группах устойчивых гибридов, чем в контроле, но меньше, чем в неустойчивых гибридах. Транскриптомный анализ показал дифференциальную экспрессию генов, связанных с метаболизмом, биосинтезом вторичных метаболитов, фотосинтезом и трансдукцией сигналов гормонов. Особый интерес вызвали НАДФ(+)-подобная 2-алкенальредуктаза, GST 23-подобная глутатионтрансфераза, CYP736A12-подобный цитохром P450, белки COPT6 и металлотионеин-подобный белок. Генотипирование гибридных растений березы маркерами SSR и SNP. Получены результаты генотипирования гибридных форм берёзы. Всего по группе УУ получено 253 растения, по группе УН 378 растений, по группе НН 291 растение. Первичный скрининг проводили с помощью микросателлитных маркеров SSR на гены, которые так или иначе вовлечены в защитные реакции на стрессы засухи или дефицита азота. Из группы гибридов УУ из 253 растений отобрано 25 потенциально устойчивых, из группы УН из 378 растений - 15, из группы НН из 291 растений - 10. Скрининг гибридов проведен по 107 SNP полиморфным маркерам. Из трёх групп суммарно отобрано всего 7 генотипов, у которых выявлено максимальное числом SNP маркеров из набора 107 маркеров, условно ассоциированных с признаком устойчивости к засухе. Оформлены заявки на селекционные достижения устойчивых генотипов дуба (1 шт) и березы (1 шт). По результатам проведенных исследований подготовлено шесть публикаций в российских и зарубежных журналах, а также сделан доклад на российской конференции.

Публикации