Аптамеры как инструменты повышения противоопухолевой эффективности онколитического вируса VV-GMCSF-Lact для терапии злокачественных опухолей головного мозга

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-64-00041

НазваниеАптамеры как инструменты повышения противоопухолевой эффективности онколитического вируса VV-GMCSF-Lact для терапии злокачественных опухолей головного мозга

Руководитель Кулигина Елена Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №75 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова онколитический вирус, виротерапия, опухоли головного мозга человека, персонализированные 3D –клеточные культуры, аптамеры, нейтрализующие антитела

Код ГРНТИ34.15.51

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Глиомы III - IV степени злокачественности – самые агрессивные опухоли головного мозга, характеризующиеся высокой летальностью и высокой частотой рецидивов. Стандартные методы терапии - хирургическая резекция с последующей химиотерапией темозоломидом и лучевой терапией не приводят к выздоровлению пациента и/или значительному увеличению выживаемости. Таким образом, разработка новых стратегий лечения и эффективных лекарственных препаратов представляет собой важную биомедицинскую задачу. Отсутствие релевантных доклинических моделей глиом не позволяет оценить истинную эффективность инновационных противоопухолевых препаратов. Для тестирования противоопухолевых препаратов нового поколения необходимо использовать релевантные клеточные модели, первичные 3D – культуры, полученные из образцов ткани пациентов с диагнозом глиома. Модельная опухоль у животных должна состоять из зоны инвазивного роста, некротической центральной области и зоны патологического роста сосудов. В проекте будет использована ортотопическая модель 3D–культуры глиомы человека, разработанная и внедренная сотрудниками КрасГМУ на мышах с лекарственной иммуносупрессией. Использование животных с иммуносупрессией позволит оценить терапевтический потенциал исследуемого лекарственного средства у онкологических пациентов с иммунной недостаточностью. Онколитическая виротерапия является перспективным подходом для лечения онкологических заболеваний в связи с селективностью поражения опухолевых клеток, возможностью иммуномодуляции организма пациента и использования совместно с химио- и лучевой терапией. ИХБФМ СО РАН совместно с ГНЦ ВБ «Вектор» разработал противоопухолевое лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины. В 2019 г. успешно завершены доклинические исследования VV-GMCSF-Lact как препарата для терапии опухолей молочной железы. Клинические испытания препарата проходят на базе ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург. Данные о клинических испытаниях размещены в базе данных ClinicalTrials.gov. Ранее, в экспериментах на культурах клеток было показано, что VV-GMCSF-Lact обладает высокой онколитической активностью по отношению к опухолям головного мозга. Для изучения противоопухолевой эффективности вируса в отношении опухолей внутричерепной локализации целесообразно исследовать внутривенный способ введения препарата как наименее инвазивный. При введении в организм вирус провоцирует выработку вирус-нейтрализующих антител, которые могут снижать его противоопухолевый эффект. Экранировать вирусы от влияния иммунной системы можно с помощью аптамеров, покрывающих оболочку вирусной частицы. Сотрудники КрасГМУ имеют как опыт селекции аптамеров, защищающих вирусные частицы онколитической осповакцины от действия нейтрализующих антител, так и опыт математического моделирования новых аптамеров. В настоящем проекте предполагается сконструировать бифункциональный аптамер одновременно для защиты VV-GMCSF-Lact от нейтрализующих антител и для адресной доставки вирусных частиц к опухолевым клеткам глиом. Таким образом, при выполнении проекта оценка противоопухолевого потенциала VV-GMCSF-Lact будет проведена на релевантных опухолевых моделях: первичных 3D–культурах глиом человека, полученных из образцов опухолей пациентов и трансплантированных животным с лекарственной иммуносупрессией. Для увеличения терапевтического потенциала рекомбинантного вируса VV-GMCSF-Lact будут впервые использованы аптамеры, ингибирующие агрегацию вирусных частиц, защищающие вирусные частицы от действия нейтрализующих антител и способствующие адресной доставке вирусов к опухолевым клеткам. Для успешной реализации проекта необходима слаженная работа междисциплинарного коллектива, объединяющего специалистов разного профиля – молекулярных биологов, биохимиков и нейрохирургов. В данном проекте предполагается совместная работа сотрудников ИХБФМ СО РАН и КрасГМУ.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Дымова М.А., Кичкайло А.С., Кулигина Е.В., Рихтер В.А. Aptamers as tools for enhancing the antitumor efficacy of oncolytic viruses Pharmaceutics (год публикации - 2023)

2. М. А. Дымова, Е. В. Кулигина, В. А. Рихтер, П. В. Артюшенко, А. В. Рогова, И. А. Щугорева, Ф. Н. Томилин, А. С. Кичкайло, Т.Н. Замай Получение высокоселективных аптамеров к онколитическому вирусу VV-GMCSF-Lact. Теоретические и экспериментальные подходы. Сибирское медицинское обозрение, Сибирское медицинское обозрение. 2023;(5):95-101 (год публикации - 2023)
10.20333/25000136-2023-5-95-101

3. Т.Н. Замай, М.А. Дымова, А.А. Народов, А.А. Кошманова, Д.С. Грек, И.И. Воронковский, А.К. Горбушин, А.С. Кичкайло, Е.В. Кулигина, В.А. Рихтер, Р.А. Зуков АПТАМЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА Сибирский онкологический журнал, СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2023; 22(5): 105–117 (год публикации - 2023)
10.21294/1814-4861-2023-22-5-105-117

4. Замай Г.С., Народов А.А., Горбушин А.К., Воронковский И. И., Грек Д.С., Замай Т.Н., Крат А.В., Коловская О.С., Лузан Н.А., Кошманова А.А., Николаева Е.Д., Волженцев А.А., Бадмаев О.Н., Лукъяненко К.А., Дымова М.А., Токарев Н.А. и др. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АПТАМЕРОВ, МЕЧЕННЫХ ИК-МЕТКОЙ Cy7.5 ДЛЯ ИНТРАОПЕРАЦИОННОГО ОКРАШИВАНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ Современные достижения онкологии в клинической практике: материалы Всерос. науч.- практ. конф., Современные достижения онкологии в клинической практике: материалы Всерос. науч.- практ. конф. (25-27 мая 2023г.) / отв. ред. И.Н. Титова. - Красноярск : тип. РПФ «СМиК», 2023. - 108 -118 стр. (год публикации - 2023)

5. Дымова М.А., Шнайдер Т.А., Чечеткина С.А., Петров Г.О., Малышева Д.О., Дроков Д.В., Агеенко А.Б., Васильева Н.С., Рихтер В.А., Кулигина Е.В. Цитотоксическое действие онколитического вируса VV-GMCSF- Lact в отношении 3D-культур клеток глиобластомы человека U-87 MG Acta biomedica scientifica, том 8 №6 (год публикации - 2023)

6. М.А. Дымова, Д.О. Малышева, В.К. Попова, Е.В. Дмитриенко, А.В. Ендуткин, Д.В. Дроков, В.С. Муханов, А.А. Бывакина, Г.В. Коченева, П.В. Артюшенко, И.А. Щугорева, А.В. Рогова и др. Characterizing aptamer interaction with the oncolytic virus VV-GMCSF-Lact International Journal of Molecular Sciences (год публикации - 2023)

7. Кичкайло А.С., Народов А.А., Комарова М.А., Замай Т.Н., Замай Г.С., и др. ...Березовский М.В. Development of DNA Aptamers for Visualization of Glial Brain Tumors and Detection of Circulating Tumor Cells Molecular Therapy - Nucleic Acids (год публикации - 2023)

8. Васильева Н., Агеенко А., Бывакина А., Сенькова А., Коченева Г., Мишинов С., Рихтер В., Кулигина Е. The Recombinant Oncolytic Virus VV-GMCSF-Lact and Chemotherapy Drugs against Human Glioma International Journal of Molecular Sciences, Vasileva, N.; Ageenko, A.; Byvakina, A.; Sen’kova, A.; Kochneva, G.; Mishinov, S.; Richter, V.; Kuligina, E. The Recombinant Oncolytic Virus VV-GMCSF-Lact and Chemotherapy Drugs against Human Glioma. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 4244. https://doi.org/10.3390/ijms25084244 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3390/ijms25084244

9. Малышева Д.О., Дымова М.А., Рихтер В.А. Analyzing aptamer structure and interactions: in silico modelling and instrumental methods Biophysical Reviews, Malysheva, D.O., Dymova, M.A. & Richter, V.A. Analyzing aptamer structure and interactions: in silico modelling and instrumental methods. Biophys Rev (2024). https://doi.org/10.1007/s12551-024-01252-z (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1007/s12551-024-01252-z

10. Морячков Р.В., Малышева Д.О., Дымова М.А., Рихтер В.А, Щугорева И.А. и Кичкайло А.С. SAXS structure studies of the aptamer to the Oncolytic Virus VV-GMCSF-Lact Journal of Siberian Federal University. Mathematics & Physics, R.V. Moryachkov, D.O. Malysheva, M.A. Dymova, V.A. Richter, I.A. Shchugoreva, A.S. Kichkailo, SAXS structure studies of the aptamer to the Oncolytic Virus VV-GMCSF-Lact, J. Sib. Fed. Univ. Math. Phys., 2024, 17(6), 783–790. EDN: VDNIGF. (год публикации - 2024)

11. Дымова М., Васильева Н., Малышева Д., Агеенко А., Щугорева И., Артюшенко П., Томилин Ф., Кичкайло А., Кулигина Е. and Рихтер В. Using Computer Modeling and Experimental Methods to Screen for Aptamers That Bind to the VV-GMCSF-LACT Virus Molecules, Dymova, M.; Vasileva, N.; Malysheva, D.; Ageenko, A.; Shchugoreva, I.; Artyushenko, P.; Tomilin, F.; Kichkailo, A.S.; Kuligina, E.; Richter, V. Using Computer Modeling and Experimental Methods to Screen for Aptamers That Bind to the VV-GMCSF-LACT Virus. Molecules 2024, 29, 5424. https://doi.org/10.3390/molecules29225424 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.3390/molecules29225424

12. Агеенко А., Васильева Н., Рихтер В., Кулигина Е. Combination of Oncolytic Virotherapy with Different Antitumor Approaches against Glioblastoma International Journal of Molecular Sciences, Ageenko, A.; Vasileva, N.; Richter, V.; Kuligina, E. Combination of Oncolytic Virotherapy with Different Antitumor Approaches against Glioblastoma. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 2042. https://doi.org/10.3390/ijms25042042 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3390/ijms25042042

13. Прогностическое значение аптамера Gli233 для оценки прогрессирования глиобластомы Прогностическое значение аптамера Gli233 для оценки прогрессирования глиобластомы Сибирское Медицинское Обозрение, Кошманова АА, Ерахтин ЕЕ, Замай ТН, Комарова МА, Народов АА, Замай ГС, Коловская ОС, Щугорева ИА, Артюшенко ПВ, Дымова МА, Кичкайло АС. Прогностическое значение аптамера Gli233 для оценки прогрессирования глиобластомы. Сибирское медицинское обозрение. 2024;(6):53-59. DOI: 10.20333/25000136-2024-6-53-59 (год публикации - 2024)
DOI: 10.20333/25000136-2024-6-53-59

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведено исследование цитотоксичности аптамеров, специфичных к клеткам глиобластомы человека, укороченных аптамеров c наибольшей специфичностью к вирусу осповакцины и вновь созданных бифункциональных аптамеров в отношении первичных культур глиом человека и нетрансформированных клеток человека. Показано отсутствие цитотоксичности тестируемых аптамеров в указанном диапазоне концентраций (от 0,500 мкМ до 0,008 мкМ). В случае нейросфер первичной культуры глиом наблюдался слабый цитотоксический эффект аптамера №5 в концентрации 0,500 мкМ. Проведена оценка чувствительности исследуемых аптамеров к действию сывороточных нуклеаз: исследуемые аптамеры были устойчивы к ДНК-гидролизующей активности сыворотки, кроме аптамера №8, в связи с чем он был исключен из дальнейших экспериментов. С помощью микротермофореза получены значения полумаксимальных эффективных концентраций (EC50) для всех комплексов аптамер – вирус. Бифункциональный аптамер №1bi был исключен из дальнейших исследований, так как он статистически не отличался от своего контроля (№5bi). Так же определено влияние сыворотки на комплексообразование вирус -аптамер (№№ 1, 4, 5, 2bi), начиная с концентрации 4% FBS и 1,6 % сыворотки человека в культуральной среде. С помощью диффузного светорассеивания определены: гидродинамические диаметры комплексов вирус – аптамер и их дзета–потенциал в присутствии сыворотки, а также их средняя полидисперсность (PDI>0.2). Оценка синергического эффекта аптамеров и антагонистического эффекта сыворотки FBS в комбинации с VV-GMCSF-Lact в отношении клеток первичной культуры глиобластомы человека показала, что аптамер №9 имеет синергетический эффект в комбинации с онколитическим вирусом VV-GMCSF-Lact в отношении клеток первичной культуры глиобластомы человека, то есть увеличивает цитотоксичность. Показан синергетический цитотоксический эффект комбинации смеси аптамеров [1_4_5_8] и VV-GMCSF-Lact в отношении культуры клеток глиобластомы, полученной из образца опухоли, в присутствии как сыворотки содержащей нейтрализующие антитела, так в сыворотке без таковых. Цитотоксическое действие онколитического вируса VV-GMCSF-Lact в отношении клеток первичной культуры глиобластомы человека в присутствии сыворотки (FBS) и аптамеров №№ 5, 9, 2bi в различной концентрации – 200 нМ, 500 нМ было более выражено при использовании аптамера №9 в концентрации 200 нМ. На основании полученных результатов была подобрана концентрация аптамеров – 200 нМ, а также были выбраны аптамеры для создания препаратов VV-GMCSF-Lact-Apt1 и VV-GMCSF-Lact-Apt2, где Apt1 может быть №9 или 2bi, а в качестве Аpt2 лучше взять смесь аптамеров [1_4_5_8]. Стоит отметить, что согласно исследованиям соисполнителей данного проекта аптамер Gli233, входящий в состав бифункционального гибрида 2bi, имел прогностическое значение для оценки прогрессирования глиобластомы. В модели «ГЭБ in vitro» показано, что предварительная инкубация вируса VV-GMCSF-Lact с аптамерами не влияет на способность его прохождения через ГЭБ в модели in vitro. Также полученные данные свидетельствуют не только о способности VV-GMCSF-Lact проникать через ГЭБ, но и о его способности реплицироваться в таргетных опухолевых клетках спустя 24 часа инкубации с вирусным препаратом. Проведена оценка цитотоксического действия VV-GMCSF-Lact в отношении нейросфер клеток U-87 MG глиобластомы человека и химерных церебральных органоидов, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток. Была оценена эффективность репликации вируса в 3D- культурах, обнаружена активация каспазы-3, выявлена доля CASP3+ клеток в образцах, проведан оценка дифференциальной экспрессии генов (FSCN1, SLC7A5, SCUBE2, TNFRSF9), продукты которых ответственны за инвазию, пролиферацию и миграцию клеток. Однако в силу противоречивых результатов по дифференциальной экспрессии генов FSCN 1, SCUBE 2 требуются дополнительные исследования с целью выбора оптимальной клеточной 3D – модели для оценки цитотоксичности онколитического вируса VV-GMCSF-Lact. Помимо запланированных работ были проведены дополнительно: (1) работы по анализу литературных данных о последних достижениях виротерапии, как в режиме монотерапии, так и в сочетании с другими терапевтическими подходами для улучшения выживаемости и качества жизни пациентов с глиобластомой; (2) экспериментальные работы по оценке эффективности воздействия онколитического вируса VV-GMCSF-Lact в комбинации с темозоломидом, который является наиболее предпочтительным препаратом для лечения глиомы; (3) экспериментальные работы по определению структурных характеристик одного из перспективных для дальнейших работ аптамера №9 с использованием малого углового светорассеивания.

Публикации