Комбинированная терапия экспериментальной глиобластомы с помощью «усиленных» NK клеток, активированных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов и модифицированных онколитических вирусов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-64-00057

НазваниеКомбинированная терапия экспериментальной глиобластомы с помощью «усиленных» NK клеток, активированных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов и модифицированных онколитических вирусов

Руководитель Юсубалиева Гаухар Маратовна, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства" , г Москва

Конкурс №75 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова Мультиформная глиобластома, иммунотерапия, NK-клетки, TILs, CAR-T, CAR-NK, онколитические вирусы, осповакцина, VAV1, CISH, B2M.

Код ГРНТИ76.03.55

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Среди солидных опухолей мультиформная глиобластома является одной из самых некурабельных и прогностически неблагоприятных, несмотря на существенный прогресс нейрохирургической техники и таргетной терапии. Иммунотерапия и онколитическая виротерапия глиобластомы, хотя и не показали пока значимого увеличения медианы выживания, но имеют, пожалуй, наибольший потенциал среди современных методов терапии, дополняющих хирургическое лечение. В наших предыдущих проектах с помощью лентивирусной трансдукции получили линию натуральных киллеров человека YT-VAV1+, сверхэкспрессирующую поддерживающий цитотоксичность белок VAV1, и затем с помощью системы CRISPR/Cas9 на основе линии YT-VAV1+ создали две «усиленные» линии с нокаутированным геном CISH, продукт которого является негативным регулятором цитотоксичности NK-клеток, понижающим их чувствительность к IL-15, а также линию с нокаутированным геном β2-микроглобулина, обеспечивающего экспонирование на мембране MHC I класса. Нами также создана линия CAR-NK-клеток с химерным антигенным рецептором YT-CAR-EGFRvIII, показавшая высокую противоопухолевую активность в предварительных экспериментах по терапии глиобластомы in vivo на модели опухолевых ксенографтов. Анализ цитотоксичности полученных линий на первичных монослойных культурах мультиформной глиобластомы человека показал, что противоопухолевая цитотоксическая активность полученных «усиленных линий» YT-CISH-/- и YT-CAR-EGFRvIII в условиях эксперимента in vitro с клеточным монослоем мультиформной глиобластомы достоверно выше, чем у материнской линии. Цитотоксичность линий YT-VAV1+CISH-/- и YT-VAV1+B2M-/- в экспериментах на монослойных культурах достоверно не отличалась от исходно высокой цитотоксичности материнской линии YT-VAV1+. Вместе с тем, очевидно, что в условиях солидной опухоли (модель опухолевых сфероидов in vitro или опухолевые ксенографты in vivo) полученные линии с нокаутом CISH могут показать более высокую цитотоксичность, вследствие дефицита в опухоли IL15. Синергическое действие на противоопухолевую активность NK-клеток и опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TILs) можно также ожидать при комбинировании иммунотерапии c введением модифицированных онколитических вирусов. Вирус осповакцины является перспективным кандидатом для разработки рекомбинантных штаммов на его основе. Сочетание его природных онколитических свойств и высокой онкоселективности делает вирус осповакцины удачной платформой для создания специализированных штаммов для иммунотерапии. Имеются обнадёживающие результаты, показывающие эффективность применения этих вирусов для разработки противоопухолевых ДНК-вакцин. Ранее в ИМБ РАН были получены онколитические штаммы осповакцины, экспрессирующие цитокины Il15 и GM-CSF, а также содержащие антиген-связывающую последовательность одноцепочечных антител к PD-1, выключающих соответствующую ось ингибиторов иммунных контрольных точек. В нашем проекте мы планируем разработать рекомбинантные штаммы осповакцины на базе штаммов MVA и LIVP, экспрессирующие хемокины CCL3 и CCL5, усиливающие хемотаксис и иммунный ответ, а также ингибирующее мини-антитело к PD-L1. Совместно с разработанными ранее штаммами, экспрессирующими IL15, GM-CSF и анти-PD1, панель онколитических штаммов осповакцины будет испытана на опухолевых сфероидах in vitro в качестве моно- и комбинированной терапии с цитотоксическими иммунными клетками. Будет выявлен наиболее перспективный штамм вируса осповакцины для моно- и комбинированной терапии опухолевых ксенографтов in vivo. Таким образом, конечной целью настоящего проекта является проведение первичных доклинических испытаний комбинированной иммуно-виротерапии на животных с экспериментальной ортотопической глиобластомой человека с помощью “усиленных” NK-клеточных линий, активированных TILs и онколитических штаммов вируса осповакцины, несущих кДНК белков, усиливающих противоопухолевый иммунный ответ.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Воробьев П.О, Кочетков Д.В., Чумаков П.М., Закирова Н.Ф., Зотова-Нефедрова С.И., Василенко К.В., Алексеева О.Н., Кочетков С.Н., Липатова А.В., Бирке Бартош, Иванов А.В. 2‐Deoxyglucose, an Inhibitor of Glycolysis, Enhances the Oncolytic Effect of Coxsackievirus Cancers, Cancers 2022, 14, 5611 (год публикации - 2022)
10.3390/cancers14225611

2. Шакиба Ясмин, Воробьев П.О., Кочетков Д.В., Зайцева К.В., Валихов М.Р., Юсубалиева Г.М., Кальсин В.А., Забозлаев Ф.Г, Семкина А.С., Троицкий А.В., Чумаков П.М., Баклаушев В.П. Oncolytic therapy with recombinant vaccinia viruses targeting the interleukin-15 pathway elicits a synergistic response Molecular Therapy - Oncolytics, Molecular therapy oncolytics vol. 29 158-168. 2023 (год публикации - 2022)
10.1016/j.omto.2023.05.002

Публикации

1. Шакиба Я, Воробьев П.О., Махмуд М., Хамад А. Кочетков Д.В.,. Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Чумаков П.М., Липатова А.В. Recombinant Strains of Oncolytic Vaccinia Virus for Cancer Immunotherapy Biochemistry (Moscow), 8(6):823-841 (год публикации - 2023)
10.1134/S000629792306010X.

2. Шакиба Я., Набережная Е.Р., Кочетков Д.В., Юсубалиева Г.М., Воробьев П.О., Чумаков П.М., Баклаушев В.П., Липатова А.В. Comparison of the oncolytic activity of recombinant vaccinia virus strains LIVP-RFP and MVA-RFP against solid tumors Bulletin of RSMU BIOMEDICAL JOURNAL OF PIROGOV UNIVERSITY (MOSCOW, RUSSIA), Вестник РНИМУ, том 2, стр 4-11 (год публикации - 2023)
10.24075/brsmu.2023.010

3. Шакиба Я., Воробьев П.О., Науменко В.А., Кочетков Д.В., Зайцева К.В., Валихов М.П., Юсубалиева Г.М., Гуменная Я.Д, Емельянов Е.А, Семкина А.С., Чумаков П.М., Баклаушев В.П., Липатова А.В. Oncolytic Efficacy of a Recombinant Vaccinia Virus Strain Expressing Bacterial Flagellin in Solid Tumor Models Viruses, 15(4), 828 (год публикации - 2023)
10.3390/v15040828

4. Хамад А., Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П, Чумаков П.М., Липатова А.В. Recent Developments in Glioblastoma Therapy: Oncolytic Viruses and Emerging Future Strategies Viruses, 15(2), 547 (год публикации - 2023)
10.3390/v15020547

5. Шакиба Я., Воробьев П.О., Юсубалиева Г.М., Кочетков Д.В., Зайцева К.В., Валихов М.П., Кальсин В.А., Забозлаев Ф.Г., Семкина А.С., Чумаков П.М., Баклаушев В.П., Липатова А.В. Oncolytic therapy with recombinant vaccinia viruses targeting the interleukin-15 pathway elicits a synergistic response Molecular Therapy - Oncolytics, 13:29:158-168 (год публикации - 2023)
10.1016/j.omto.2023.05.002.

6. Южакова Д.В., Лукина М.М.. Сашкова Д.А., Баклаушев В.П., Можеров А.М, Дуденкова В.В, Гаврина А.И., Яшин К.С., Ширманов М.В. Development of a 3D Tumor Spheroid Model from the Patient's Glioblastoma Cells and Its Study by Metabolic Fluorescence Lifetime Imaging Sovrem Tekhnologii Med., 15(2):28-38. Epub 2023 Mar 29 (год публикации - 2023)
10.17691/stm2023.15.2.03

7. Ширманова М.В., Синюшкина С.Д., Комарова А.Д. Metabolic Heterogeneity of Tumors Molecular Biology, 57, pages1125–1142 (год публикации - 2023)
10.1134/S002689332306016X

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В результате завершения третьего этапа проекта в 2024 году созданы новые in vitro модели сложных опухолевых сфероидов, состоящих из смеси клеток глиобластомы МСК и HUVEC человека, а также новые ксенографтные модели in vivo на NSG-SGM3 и/или NOD/Scid мышах для проведения комбинированной терапии TILs или CAR-NK в сочетании с модифицированными штаммами рекомбинантных онколитических вирусов. На сингенных моделях экспериментальной глиобластомы нами изучен субпопуляционный состав опухоль-инфильтрирующих клеток перитуморального микроокружения в ответ на проводимую онколитическую терапию рекомбинантным штаммом вируса осповакцины (LIVP-IL15-RFP, любезно предоставлен А.В. Липатовой, ИМБ РАН). Мы показали, как меняется активность некоторых субпопуляций на введение вируса в опухоль, как происходит экспансия NК клеток периопухолевом пространстве в ответ на введение LIVP-IL15-RFP. Разработан протокол получения и культивирования выделенных клеток первичной глиобластомы, в гипоксических условиях с применением плазмоподобной среды, максимально сохраняющий первоначальный фенотип опухолевых клеток. Из полученных культур первичных глиобластом, мы создали сложные 3D сфероиды, включающие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и эндотелиальные клетки. Обнаружено, что в смешанных сфероидах (1:1 клетки GBM и MSC человека) наблюдается распределение CD133-позитивных стволовых опухолевых клеток и CD44 позитивных клеток по поверхности сфероида, а нестин-позитивных клеток в среднем слое (см. pdf файл). В ряде случаев, например, при добавлении в сфероид HUVEC, МСК распределялись равномерно по сфероиду, а иногда занимали центральное положение. CD31 позитивные эндотелиоциты всегда распространялись по поверхности сфероида. Представляется крайне интересным на следующих этапах проекта изучить цитокиновый профиль сложных сфероидов, в частности, методом мультиплексного анализа. Апробирована новая модель интракраниальной ксенографтной глиобластомы человека на NSG и/или NOD/Scid мышах для проведения моно- и комбинированной терапии иммунными клетками в сочетании с модифицированными штаммами онколитических вирусов. Исследование выполнено на 15 мышах, которым имплантировали клетки первичной культуры, выращенной в условии гипоксии и культивированной в плазмоподбной среде. Культуру глиомы трансдуцировали флюоресцентными трейсерами в зависимости от конкретной задачи (mKate, mCherry, mScarlet. GFP, BFP). Полученные интракраниальные ксенографты оценили методом МРТ и показали, что новая технология подготовки клеток к трансплантации, а также имплантация глиомных клеток с добавлением во вводимый препарат МСК человека способствует практически 100%-ному приживлению и относительно быстрому прогрессированию опухоли. Иммуногистохимическое исследование препаратов опухоли подтвердило наличие маркеров глиобластомы человека. Отработан протокол монотерапии экспериментальной глиобластомы онколитическими вирусами, экспрессирующими IL15, GM-CSF, anti-PD 1, CCL3 и CCL5 на NSG и/или NOD/Scid мышах. Для каждого из перечисленных рекомбинантных штаммов онколитических вирусов осповакцины подбирали способ введения и безопасную терапевтическую дозу. В эксперименте с терапией LIVP-IL-15-RFP ксенографтов глиобластомы у мышей Nod/Sсid мы провели подробный иммунофлюоресцентный анализ микроокружения и реакции астроглии в ответ на инвазивный рост глиомы и последующую интратуморальную инъекцию rVV. В результате проведенного исследования мы подтвердили что у этих мышей практически отсутствуют CD8+ CTL и СD56+ NK в перитуморальной зоне, несмотря на инфекцию rVV и подтверждённую экспрессию IL-15 инфицированными клетками. Во-вторых мы, показали, что внутриопухолевая инъекция вируса с IL-15 у Nod/Scid сопровождается активной перитуморальной инфильтрацией CD45+ мононуклеаров и CD206+ макрофагов и стромальных клеток. В-третьих, мы обнаружили, что терапия LIVP-IL-15-RFP никак не влияет на перитуморальную инфильтрацию CD19+ В-клетками (см. pdf файл). При этом в результате терапии и репликации LIVP-IL-15-RFP в опухоли значительно возрастает реактивная астроглиальная реакция, затрагивающая практически всё ипсилатеральное полушарие. В процессе экспериментов по безопасности монотерапии rVV определена безопасная доза онколитических вирусов для системного и локального введения иммунодефицитным мышам Nude, Nod/Scid и NSG-SGM3. При стереотаксическом введении мышам Nod/Scid доза 10^5 БОЕ в 10 мкл, не сопровождалась летальностью и при этом регистрировался сигнал RFP в опухоли через 48 часов после введения. При введении в хвостовую вену мышам Nod/Scid безопасно регистрировали сигнал репортёрного гена в опухоли через 72 часа при введении 10^6 БОЕ в 100 мкл (т.е. в 10 раз больше вирусных частиц). При комбинированной терапии безопасной дозой EGFRvIII-CAR-NK на фоне проведения терапии вирусами оказалось 10^5 клеток в общем объёме 10 мкл при стереотаксическом введении и 5*10^4 клеток в объёме 100 мкл стерильного DPBS при внутривенном введении. Более высокие дозы EGFRvIII-CAR-NK, так же, как и более высокие дозы rVV вызывали у мышей летальные исходы, причём иногда – «на конце иглы». Отработан протокол монотерапии экспериментальной глиобластомы рекомбинантным онколитическим вирусом LIVP-IL15-RFP, экспрессирующим IL15, LIVP-GM-CSF-RFP, LIVP-CCL3-RFP и LIVP-CCL5-RFP на иммунодефицитных мышах Nude. По результатам in vivo биолюминесценции, КП ОКТ, FLIM ex vivo показаны эффекты в опухолевой ткани при стереотаксическом введении перечисленных rVV, экспрессирующих GM-CSF, CCL3 и CCL5 в виде монотерапии и в комбинации с модифицированными натуральными киллерами. Выявлена высокая гетерогенность аутофлюоресцентного профиля опухолей, наблюдались изменения в параметрах времени жизни аутфофлюоресценции 𝜏1 и 𝜏2. Исследование комбинированной терапии показало более эффективные сдвиги в аутофлюоресцентном профиле опухолей, а именно статистически значимое снижение всех трех параметров 𝜏1 и 𝜏2 и a1 у всех мышей в группе с комбинированной терапией и меньшую вариабельность параметров внутри группы между отдельными особями, что может свидетельствовать об эффективном сдвиге фенотипа опухоли к менее агрессивному. Эффективность доставки LIVP-IL15 показана как при стереотаксическом, так и при внутривенном введении. Результаты получены как in vivo, методом биоимиджинга, так ex vivo методом проведенного иммунофлюоресцентного анализа на срезах головного мозга через 96 часов после введения. Для подтверждения синтеза таргетных цитокинов в опухоли и периглимоной зоне через 96 после введения рекомбинантных штаммов VV с последовательностями IL15, anti-PD 1, CCL3 и CCL5, на следующем этапе запланировано проведение иммуноблотинга и количественного иммуноферментного анализа, а также выбор оптимальной схемы комбинированной иммунотерапии и исследование её эффективности с помощью оценки выживаемости леченных животных.

Публикации

1. Бугакова А.С., Чудакова Д.А., Мызина М.С., Янышева Э.П., Озерская Ю.В., Соболева А.В., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. Non-Tumor Cells within the Tumor Microenvironment—The “Eminence Grise” of the Glioblastoma Pathogenesis and Potential Targets for Therapy Cells , Том 13, номер 10, стр. 808 (год публикации - 2024)
10.3390/cells13100808

2. Ю.В. Озерская, Г.М. Юсубалиева, К.А. Зыков, В.П. Баклаушев Опухоль-инфильтрирующие лимфоциты при раке легкого: выделение, характеристика, активация, терапевтический потенциал. Сборник тезисов ХимБиоSeasons, ХИМБИОSEASONS 2024. Сборник тезисов докладов X юбилейного всероссийского форума молодых исследователей. Калининград, 2024 (год публикации - 2024)

3. Янышева Э.П., Кирсова Д.П., Кузнецова С.М., Пуленова М.М., Ширманова М.В., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. Роль регуляторных Т-лимфоцитов и опухоль-ассоциированных мезенхимальных стволовых клеток в формировании микроокружения глиобластомы LIFT ШКОЛА МОЛОДОГО НЕЙРОТЕХНОЛОГА Тезисы участников конференции (26–27 апреля 2024 года) Текстовое электронное издание, LIFT Школа молодого нейротехнолога: тезисы участников конференции (26–27 апреля 2024 г.); ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. — Москва: Квант Медиа, 2024. — 121-123 с. (год публикации - 2024)
10.24412/CL-37228-2024-121-123

4. С. М. Кузнецова, В. А. Кальсин, В. П. Баклаушев, Г. М. Юсубалиева Разработка сложной трехмерной модели опухоли глиобластомы: перспективы исследования опухолевой пролиферации в кокультивировании со стромальными и эндотелиальными клетками LIFT Школа молодого нейротехнолога, LIFT Школа молодого нейротехнолога: Тезисы участников конференции (26–27 апреля 2024 года) Текстовое электронное издание Москва, Квант Медиа, 2024 Стр. 148 (год публикации - 2024)
10.24412/CL-37228-2024-148-150

5. Набережная Е., Соболева А.В., Воробьев П., Вадехина В., Юсубалиева Г.М., Исаева И.В., Баклаушев В.П., Чумаков П., Липатова А.В. Рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий интерферон 1 типа как платформа для селективной иммунотерапии глиобластомы и меланомы Журнал "Bulletin of Russian State Medical University", №6. С. 19–28 (2024) (год публикации - 2024)
10.24075/vrgmu.2024.072

6. Сачкова Д.А., Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Ширманова М.В., Южакова Д.В Оценка эффективности новых терапевтических агентов для иммунотерапии и виротерапии глиобластомы пациентов на основе изучения метаболического ответа клеток с использованием флуоресцентного время-разрешенного биомиджинга Сборник материалов Х Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием "ВолгаМед 2024" , Сборник материалов Х Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием "ВолгаМед 2024", г. Н.Новгород, 27-29 марта 2024 г. Стр 64-66. (год публикации - 2024)

7. Д.В. Южакова, Д.А. Сачкова, М.В. Ширманова, А.М. Можеров, В.П. Баклаушев, Г.М. Юсубалиева Оценка влияния «усиленных» естественных киллеров, нокаутных по генам CISH и B2M, на жизнеспособность и метаболический статус клеток 3D сфероидов глиобластомы пациентов Журнал “Современные технологии в медицине”, 2025; 17(1): 109 (год публикации - 2025)
10.17691/stm2025.17.1.10

8. Агеенко А.Б., Васильева Н.С., Юсубалиева Г.М., Сенькова А.В., Ромащенко А.В., Забозлаев Ф.Г., Дымова М.А., Рихтер В.А, Кулигина Е.В. Efficacy of Oncolytic Virus VV-GMCSF-Lact Against Immunocompetent Glioma Cells , 14(20), 1619 (год публикации - 2025)
10.3390/cells14201619

9. Янышева Э.П., Мельников П.А., Чудакова Д.А., Ширманова М.В., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. Регуляторные T-клетки в периопухолевом микроокружении экспериментальной глиобластомы Журнал «Современные технологии в медицине», vol. 17, no. 1, 2025, pp. 70-80 (год публикации - 2025)
10.17691/stm2025.17.1.07

10. Жукова О.А., Озерская Ю.В., Басманов Д.В., Столяров В.Ю., Богуш В.Г., Колесов В.В., Зыков К.А., Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П. «Легкое-на-чипе» как инструмент для изучения патофизиологии дыхания человека «Клиническая практика» , Том 15, № 4 (2024) (год публикации - 2024)
10.17816/clinpract637140

11. Г.М. Юсубалиева, А.В. Липатова, М.В. Ширманова, В.П. Баклаушев Комбинированная терапия глиобластомы с помощью CAR NK-клеточных препаратов и модифицированных онколитических вирусов в эксперименте Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика, том 17, № 1, 2024 (год публикации - 2024)

12. Пуленова М.М., Кирсова Д.П., Мызина М.С., Смирнова О.А., Липатова А.В., Калинкин А.А., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. Доставка таргетных белков в глиомные клетки с помощью рекомбинантных штаммов LIVP Научно-теоретический медицинский журнал «Морфология» (год публикации - 2024)

13. Сачкова Д.А., Южакова Д.В., Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Можеров А.М., Ширманова М.В. Изучение метаболического ответа клеток 3D модели глиобластомы пациентов после воздействия "усиленными" NK клетками и модифицированным онколитическим вирусом на основе FLIM-имиджинга Биосистемы: организация, поведение, управление, Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н.Новгород, 15-19 апреля 2024 г.). Н. Новгород Стр. 320 (год публикации - 2024)

14. Шиндяпин В.В., Губернаторова Е.О., Горшкова Е.А., Чичерина Н.Р., Сысонов Ф.А., Яковлева А.С., Богданова Д.А., Демидов О.Н., Самсонова М.В., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Друцкая М.С. Myeloid cell mobilization and recruitment by human mesothelioma in NGS-SGM3 mice Cells, 13 (24): 2135 (год публикации - 2025)
10.3390/cells13242135

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В исследовании с помощью мультиплексного анализа были проанализированы уровни 35 цитокинов в 2D-культурах и 3D-сфероидах из клеток GBM и MSC. Обнаружено, что цитокиновый профиль сфероидов сложного состава существенно отличается от простых опухолевых сфероидов и от 2D кокультур. Примечательно, что в 2D кокультурах GBM и MSC наблюдалось взаимоингибирующее влияние на уровень провоспалительных цитокинов, таких как TNF, IL-6, IL8 и хемокинов CCL2, CCL7, CCL22, CXCL10. В сложных 3D сфероидах, наоборот, наблюдалось взаимоактивирующее влияние на некоторые провоспалительные цитокины и хемокины (IL-6, IL-8, CCL2, CX3CL1), уровень которых был существенно выше, чем в моносфероидах GBM и MSC. Уровень VEGF продемонстрировал взаимно усиливающее влияние GBM и MSC, как в 2D культурах, так и особенно в составных сфероидах. Это свидетельствовало о синергичном проангиогенном действии GBM и MSC. В целом, эксперимент с простыми и составными сфероидами продемонстрировал иммуномодулирующую активность MSC, при этом оказалось, что они являются основными продуцентами провоспалительных хемокинов (IL-6, IL-8, CCL2, CCL7), которые могут поддерживать прогрессию глиобластомы через рекрутирование иммунных клеток и ангиогенез. Весьма интересные данные получены при исследовании оси хемокинов CX3CL1-CX3CR1: фракталкин (CX3CL1) оказался повышен в 3D кокультурах GBM+MSC (142 пг/мл) по сравнению с MSC (75 пг/мл). Суммарно, полученные нами данные о цитокиновом профиле в сложных сфероидах заставляют переосмыслить представления о роли ряда провоспалительных цитокинов и молекулярных механизмах поддерживающего опухоль действия МСК. В экспериментах на опухолевых сфероидах мы также определяли экспрессию целевых трансгенов, доставляемых соответственно рекомбинантными вирусами осповакцины LIVP-mIL-15-RFP, LIVP-hIL-15-RFP и LIVP-hCCL5-RFP. Эксперименты с заражением сложных модельных сфероидов GBM+MSC показали, что наблюдается не менее чем двухкратное повышение уровня CCL5, секретируемого в кондиционированную среду после заражения клеток LIVP-hCCL5-RFP. Эксперименты in vivo показали, что при стереотаксической инъекции LIVP-hIL-15-RFP иммунодефицитным мышам в очаг ксенографтной опухоли наблюдается достоверное повышение уровня экспрессии IL-15 в опухоли. Для оценки экспрессии компонентов хемокиновой оси CX3CL1-CX3CR1 в ткани головного мозга мыши был проведён количественный иммуноферментный анализ этих белков в образцах ткани сингенной глиомы GL261 у мышей линии C57BL/6. Сравнительный анализ содержания лиганда CX3CL1 (фракталкина) показал, что содержание CX3CL1 в глиобластоме было в 3.8 раза выше, чем в нормальной ткани головного мозга. Соотношение лиганд/рецептор (CX3CL1/CX3CR1) в глиобластоме составило 3.79 против 0.63 в норме, что свидетельствует о значительном дисбалансе хемокиновой оси с преобладанием лиганда в опухолевом микроокружении. Примечательно, что двукратное стереотаксическое введение TILs привело к резкому увеличению соотношения лиганд/рецептор до 10.33, что обусловлено снижением содержания рецептора CX3CR1 до 4.8 ± 1.0 нг/мл при сохранении высокого уровня лиганда. Комбинированная терапия LIVP+TILs характеризовалась промежуточным значением соотношения (3.39) с наиболее высоким содержанием рецептора среди всех терапевтических групп (15.2 ± 11.5 нг/мл). Эксперименты по оценке эффективности моно- и комбинированной иммунотерапии проводили на сингенных мышах C57BL/6 c имплантированной ортотопической глиомой GL261. В качестве онколитического вируса применили рекомбинантный вирус осповакцины LIVP-mIL-15-RFP, в качестве TILs – мышиные опухоль-инфильтрирующие лимфоциты, выделенные из образцов 15-дневной глиомы, нарощенные и активированные согласно разработанному нами протоколу. Сравнение эффективности иммунотерапии показало, что достоверное снижение объёма глиомы по сравнению с контролем (глиома GL261 у мышей С57BL/6 без терапии) наблюдалось в группах LIVP-mIL15-RFP (7+15 сут) – онколитическая виротерапия, двукратная стереотаксическая инъекция на 7 и 15 сутки; TIL (7+15 сут) - клеточная иммунотерапия, двукратная стереотаксическая инъекция TILs на 7 и 15 сутки и в группе комбинированной иммунотерапии (LIVP-mIL15-RFP+TIL – комбинированная терапия, двукратно вирусы и TIL на 7 и 15 сутки. При этом максимальная медиана выживания наблюдалась в группе комбинированной иммунотерапии. Анализ аутофлюоресценции НАД(Ф)Н методом FLIM показал, что лечение сингенной модельной глиобластомы вирусом LIVP-RFP либо иммунным клетками TILs приводило к однонаправленному эффекту – увеличению абсолютных параметров времени жизни (τ1, τ2) и снижению вклада короткой компоненты a1 по сравнению с соответствующими контрольными группами, что приводило к общему росту τm в ткани глиобластомы. Данные изменения могут быть ассоциированы со сдвигом метаболизма опухоли от более агрессивного гликолитического фенотипа в сторону менее агрессивного окислительного фосфорилирования (снижение a1) и, соответственно с усилением митохондриальной активности (рост τ2) в ходе противоопухолевой терапии. После проведения анализа с помощью технологии FLIM, на следующем этапе осуществлялось исследование структурных особенностей тканей головного мозга мышей путем оценки рассеивающих и поляризационных свойств методом кросс-поляризационной ОКТ (КП ОКТ). Отмечено, что в случае терапии вирусом LIVP-RFP выраженные изменения значений коэффициента затухания проявляются отсроченно. В случае же терапии TILs для выраженных изменений коэффициента затухания необходима наиболее мощная схема лечения с двойным введением агента. Таким образом, полученные нами данные методом FLIM и КП ОКТ позволили охарактеризовать метаболические параметры опухоли и периопухолевого пространства в процессе иммунотерапии в моно- и комбинированном режимах.