Оптические методы мониторинга эндоцитоза микро- и нанообъектов живыми клетками

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-72-10057

НазваниеОптические методы мониторинга эндоцитоза микро- и нанообъектов живыми клетками

Руководитель Дададжанов Далер Рауфович, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский университет ИТМО" , г Санкт-Петербург

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 02 - Физика и науки о космосе; 02-204 - Нано- и микроструктуры

Ключевые слова нано-биоинтерфейс, плазмон, мода шепчущей галереи, оптические резонансы, микрорезонатор, наночастица

Код ГРНТИ29.19.22

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Несмотря на активные исследования процессов клеточного захвата, в частности для проблем тераностики, они страдают существенной односторонностью, так как сосредоточены исключительно на таких аспектах этого процесса как влияние формы, размера, поверхностной модификации лигандами и заряда захватываемых частиц на факт проникновения частицы внутрь клетки. В то же время кинетика процесса проникновения оставалась пока недоступной для исследования. В последние годы благодаря развитию нанофотоники и созданию уникальных по своим свойствам наноматериалов, открылась возможность использовать их для получения более детальной картины развития процесса во времени, как in vitro, так и in vivo. Намеченная в данном проекте разработка новых оптических методов мониторинга эндоцитоза позволит решить чрезвычайно актуальную для биомедицины и биологии в целом задачу построения моделей механизмов захвата твердых частиц живой клеткой. Применение металлических наночастиц для исследования данных процессов актуально по нескольким причинам. Во-первых, они являются биосовместимыми. Во-вторых, их уникальные оптические свойства являются хорошо предсказуемыми, а большое сечение поглощения и рассеяния дает возможность их исследования оптическими методами без применения флуоресцентных меток. Свойства металлических наночастиц определяются их физико-химическими свойствами, такими как размер, морфология, присутствие поверхностных лигандов и окружающей средой. Следовательно, в процессе эндоцитоза плазмонных наночастиц, а именно при инвагинации плазматической мембраной, формируется гибридная структура, оптические свойства которой могут быть определены путем измерения спектрального сдвига плазмонной частоты. Существенной новизной обладает предлагаемый способ изучения процесса проникновения наночастиц через клеточную мембрану внутрь клетки посредством наблюдения расщепления первоначально вырожденных плазмонных мод в сферической наночастице. Этот эффект возникает за счёт нарушения сферической симметрии при приближении наночастицы к клеточной мембране. В результате дипольная мода плазмонных колебаний, трехкратно вырожденная в сферических частицах, находящихся вдали от мембраны, при приближении к мембране расщепляется, а после ее прохождения и попадания частицы в клетку вырождение восстанавливается. Предлагаемый способ исследования кинетики эндоцитоза уникален, так как позволяет проводить точные измерения в реальном времени с нанометровым разрешением в дальнем поле на стандартных спектральных приборах. Другим подходом для решения заявленной проблемы является разработка методов управления электромагнитным излучением в субклеточном масштабе на основе миниатюрных оптических резонаторов с модами шепчущей галереи внутри диэлектрических микросфер, при возбуждении которых могут наблюдаться высокодобротные резонансы и вынужденное излучение. Их высокая добротность и рекордная чувствительность делают их привлекательными в биологических приложениях, а именно для эффективного усиления флуоресценции и генерации лазерного излучения в биологических средах. Благодаря развитию этого направления открывается возможность создания биолазера с контролируемыми оптическими свойствами. Использование мод шепчущей галереи в микросферах показало свою работоспособность как при детектировании единичных молекул, так и ионов. Новизной в данном случае будет помещение плазмонной наноструктуры на поверхность резонаторов мод шепчущей галереи. Несмотря на то, что это снизит добротность резонатора, за счёт уменьшения эффективного объема моды в плазмонной частице общая чувствительность системы возрастет.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Дададжанов Д.Р., Палехова А.В., Алексан Г., Баранов М.А., Маслова Н.А. ФОРМИРОВАНИЕ ОЛИГОМЕРОВ СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ ЛАЗЕРНОЙ АБЛЯЦИИ В ЖИДКОСТИ, ПУТЕМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ И УЛЬТРАСОНИФИКАЦИИ: УПРАВЛЯЕМЫЙ ДЛИННОВОЛНОВЫЙ СДВИГ ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА В ИНТЕРЕСАХ БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРИМЕНЕНИЙ Оптика и спектроскопия (год публикации - 2023)

2. Старовойтов А.А., Фандеев А.А., Никитин И.Ю., Гладских И.А., Дададжанов Д.Р. МОНИТОРИНГ ЛОКАЛИЗОВАННОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА НЕОДНОРОДНОГО АНСАМБЛЯ СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ НА ГРАНИЦЕ ДВУХ СРЕД Оптика и спектроскопия (год публикации - 2023)

3. Малеева К.А., Дададжанов Д.Р., Палехова А. В., Калия И.Е., Ткач А.П., Баранов А.В., Богданов К.В. SERS substrates based on polymer-protected self-assembled plasmonic films with gold nanoparticles as enhancing element of a microfluidic sensor Elsevier, Т. 146, С. 114581. (год публикации - 2023)
10.1016/j.optmat.2023.114581

4. Далер Дададжанов, Анастасия Сапунова, Антонина Дададжанова, Георгий Алексан, Тигран Вартанян On-Chip Photonics: Principles, Technology and Applications (Chapter 6: Biosensing) Elsevier (год публикации - 2024)
10.1016/B978-0-323-91765-0.00005-0

5. Е. О. Соловьева, К. Курасова, К. В. Богданов, Д. Р. Дададжанов, А.А. Старовойтов, Н. А. Торопов Whispering-gallery microlasers doped with plasmonic nanoparticles SPIE (год публикации - 2024)

6. КОЧАКОВ А.В., МИТУСОВА А.А., КОНОНОВ Д.В., ДАДАДЖАНОВ Д.Р. СПЕКТРОСКОПИЯ ЗОЛОТЫХ И СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ В РАКОВЫХ КЛЕТКАХ Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ", Т. 24. – С. 73-74. (год публикации - 2024)

7. Александра В. Афанасьева, Евгения О. Соловьева, Игорь А. Гладских, Тигран А. Вартанян, Далер Р. Дададжанов Nanovoid irregular array in plasmonic Ag@Au nanostructures SPIE (год публикации - 2024)

8. К. Курасова, Н. А. Филатов, Г. Алексан, А. И. Дададжанова, Д. Р. Дададжанов, Н. А. Торопов, Т. А. Вартанян Microfluidic Fabrication of Polymeric Microspheres Doped with Quantum Dots for Biosensors Optica Publishing Group, Kurassova K. et al. Microfluidic Fabrication of Polymeric Microspheres Doped with Quantum Dots for Biosensors //Optical Sensors. – Optica Publishing Group, 2023. – С. SM3D. 3. (год публикации - 2023)
10.1364/SENSORS.2023.SM3D.3

9. ХОТТОН М.С., КУРАСОВА К., ТОРОПОВ Н.А., ВОЛЬМЕР Ф. LIGHT-MATTER COUPLING IN OPTICAL MICROCAVITIES Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. АМ Прохорова Российской академии наук, №. 23. – С. 18-18. (год публикации - 2023)

10. ДАДАДЖАНОВ Д.Р., ПЕТРОВ Н.С., СМИРНОВА Е.С., ВАРТАНЯН Т.А. INTRACELLULAR TRAFFICKING USING PLASMON RESONANCE IN SILVER AND GOLD NANOPARTICLES WITH ARBITRARY SHAPE Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. АМ Прохорова Российской академии наук, №. 23. – С. 26-26. (год публикации - 2023)

11. Соловьева Е.О., Курасова К., Старовойтов А.А., Торопов Н.А Апробация плазмонных наночастиц для создания низкопороговых микролазеров на основе полимерных микросфер Издательско-полиграфическая ассоциация высших учебных заведений (Санкт-Петербург), С. 168-170. (год публикации - 2023)

12. Антон А. Старовойтов, Евгения О. Соловьева, Камилла Курасова, Кирилл В. Богданов, Ирина А. Арефина, Наталья Н. Шевченко, Тигран А. Вартанян, Далер Р. Дададжанов, Никита А. Торопов Carbon Dot-Decorated Polystyrene Microspheres for Whispering-Gallery Mode Biosensing MDPI (год публикации - 2024)

13. Камилла Курасова, Никита Филатов, София Карамышева, Антон Букатин, Антон Старовойтов, Тигран Вартанян, Фрэнк Воллмер, Никита Торопов Microfluidics-Driven Dripping Technique for Fabricating Polymer Microspheres Doped with AgInS2/ZnS Quantum Dots American Chemical Society, Kamilla Kurassova, Nikita Filatov, Sofia Karamysheva, Anton Bukatin, Anton Starovoytov, Tigran Vartanyan, Frank Vollmer, Nikita A. Toropov. Microfluidics-Driven Dripping Technique for Fabricating Polymer Microspheres Doped with AgInS2/ZnS Quantum Dots // ACS Omega. – 2024. – Vol. 9, No. 37. – P. 39287-39295. (год публикации - 2024)
10.1021/acsomega.4c07270

14. Кочаков А.В., Митусова А.А., Дададжанов Д.Р., Кононов Д.В., Петров Н.С. Monitoring cellular uptake of gold nanoparticles by stationary absorption spectroscopy IEEE, Kochakov A. V. et al. Monitoring cellular uptake of gold nanoparticles by stationary absorption spectroscopy //2024 International Conference Laser Optics (ICLO). – IEEE, 2024. – С. 541-541. (год публикации - 2024)
10.1109/ICLO59702.2024.10624015

15. Дададжанов Д.Р., Петров Н.С., Палехова А.В., Гладских И.А., Вартанян Т.А., Маркович Г. Laser-driven formation of chiral and achiral plasmonic nanostructures for biosensing applications Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. АМ Прохорова Российской академии наук», Dadadzhanov D. R. et al. Laser-driven formation of chiral and achiral plasmonic nanostructures for biosensing applications //Сборник трудов конференции «International Conference on Advanced Laser Technologies (ALT)». – Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. АМ Прохорова Российской академии наук», 2024. – №. 24. – С. 20-20. (год публикации - 2024)

16. Старовойтов А.А., Соловьева Е.О., Курасова К., Богданов К.В., Арефина И.А., Шевченко Н.Н., Митусова А.А., Вартанян Т.А., Дададжанов Д.Р., Торопов Н.А. Spherical microlasers with carbon dots and organic dyes Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. АМ Прохорова Российской академии наук», Starovoytov A. A. et al. Spherical microlasers with carbon dots and organic dyes //Сборник трудов конференции «International Conference on Advanced Laser Technologies (ALT)». – Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. АМ Прохорова Российской академии наук», 2024. – №. 24. – С. 55-55. (год публикации - 2024)

17. Соловьева Е.О., Курасова К., Богданов К.В., Старовойтов А.А., Торопов Н.А., Шевченко Н.Н., Вартанян Т.А. Lasing of Polymer Microspheres Doped with AgInS2 Quantum Dots and Plasmonic Nanoparticles IEEE, Soloveva E. O. et al. Lasing of Polymer Microspheres Doped with AgInS2 Quantum Dots and Plasmonic Nanoparticles //2024 International Conference Laser Optics (ICLO). – IEEE, 2024. – С. 368-368. (год публикации - 2024)
10.1109/ICLO59702.2024.10624520

18. Соловьева Е. О., Курасова К., Богданов К. В., Арефина И. А., Дададжанов Д. Р., Старовойтов А. А., Торопов Н. А. Whispering-Gallery Mode Biosensor Based on Polystyrene Microspheres Doped with Carbon Dots Optica Publishing Group, Soloveva E. O. et al. Whispering-Gallery Mode Biosensor Based on Polystyrene Microspheres Doped with Carbon Dots //Optical Sensors. – Optica Publishing Group, 2024. – С. SM1H. 4. (год публикации - 2024)

19. Соловьёва Е.О., Шевченко Н.Н., Кирилкин Н.С., Рогачёв А.А., Ковова М.С., Тилин А.С., Русакова В.А., Шипиловских С.А., Старовойтов А.А., Дададжанов Д.Р., Торопов Н. Inherent luminescence in undoped polystyrene microbeads supporting whispering-gallery modes Elsevier, Amsterdam (год публикации - 2025)
10.1016/j.optmat.2025.117058

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Методом затравочной эмульсионной сополимеризации в инертной атмосфере аргона синтезированы монодисперсные полистироловые микросферы с узким распределением размеров (коэффициент вариации около 8%). Оптимизированы параметры синтеза, включая использование гидрофобного стирола и кислоты для формирования стабильных зародышей, а также этиленгликольдиметакрилата и дивинилбензола для создания высокосшитой оболочки. Протокол паровой дистилляции позволил удалить остаточные мономеры и ароматические примеси, повысив воспроизводимость и биосовместимость продуктов. Функционализация микросфер плазмонными наночастицами была выполнена с использованием стабилизатора (CTAB), органосиланового агента APTES и импрегнацией в растворе НЧ, полученных лазерной абляцией. СЭМ-анализ подтвердил равномерное распределение наночастиц на поверхности микросфер. Использование плазмонных НЧ в микросферах, функционализированных люминофорами, приводит к росту интенсивности мод шепчущей галереи (МШГ) до 40% для углеродных точек (УТ), добротность таких микрорезонаторов составляет 10^3 при области свободной дисперсии 22 нм. Зависимость выходной интенсивности МШГ от плотности мощности накачки имеет насыщающийся характер. Конфокальная лазерная микроскопия выявила собственную люминесценцию полистирольных микросфер, связанную с окислительными дефектами (наличие карбонильных групп подтверждено пиком на 1715 см^(-1) в ИК-спектрах), что требует учета при проектировании сенсорных систем. Разработаны протоколы интеграции биосовместимых квантовых точек AIS/ZnS в структуру полистироловых микросфер во время синтеза. Варьирование стабилизаторов КТ (TOPO, олеиновая кислота, PEG) и времени ввода КТ в реакцию позволило контролировать их распределение в объеме или на поверхности при сохранении люминесцентных свойств. Отработаны методы осаждения микросфер на торец оптического волокна. Электростатическая фиксация осуществлялась для полистирольных микросфер диаметром 5 мкм и коммерческих диаметром 40 мкм с использованием APTES и полимеризацией УФ-лаком (с помощью подачи лазерного излучения с плотностью мощности 1,46 Вт/см^2 на длине волны 435 нм), что продемонстрировало высокую эффективность. Эксперименты по импрегнации микросфер в растворе КТ AIS/ZnS выявили насыщающую зависимость интенсивности люминесценции осажденных КТ от времени погружения (насыщение через 100 сек), а также обратную зависимость времени обесцвечивания КТ от интенсивности возбуждения, что указывает на фотоиндуцированную деградацию люминофоров. Исследование биосовместимости полистироловых микросфер на клеточных линиях K562, THP-1 и B16 показало высокую выживаемость (≥90% для THP-1 при концентрациях до 0,18*10^5 частиц/мл), что свидетельствует о высокой безопасности микросфер за счет отсутствия явных цитотоксических эффектов. Сравнительные эксперименты с биосовместимыми УТ показали, что выживаемость клеток THP-1 выше в случае микросфер. Экспериментальное исследование поведения светящихся микросфер в зависимости от температуры и показателя преломления окружающей среды подтвердило результаты моделирования. При изменении показателя преломления на больший, длина волны резонансов смещается в красную сторону. Для молекул альбумина чувствительность резонансов к молекулам наблюдалась до 10^(-16) M. Зависимость частот МШГ от температуры линейна в интервале от 0 до 80°C, но отклик на изменение температуры для 5-мкм частиц слабый (~1-10 пм/°C). Нагревание частиц, допированных углеродными точками, свыше 40°C приводит к заметному снижению их свечения. Использование квантовых точек AIS/ZnS для допирования микросфер позволило обнаружить побочный максимум свечения на 650 нм. Понижение температуры смещает основной максимум эмиссии в синюю область, в то время как побочный максимум практически не реагирует. Природа второго максимума требует дальнейшего изучения. Для численного моделирования эндоцитоза были получены карты распределения показателя преломления живой клетки B16 в питательной среде DMEM с использованием голографической томографии. Численное моделирование проникновения кубической наночастицы в клетку показало, что плазмонные свойства зависят от ориентации наночастицы. При ориентации, когда грань или вершина куба направлены к клетке, дипольные моды плазмонного резонанса остаются двукратно вырожденными на протяжении всего процесса эндоцитоза. При ориентации, когда грань куба направлена к клетке, вырождение снимается по мере приближения к клетке. Наибольшее расщепление плазмонного резонанса наблюдается при этой ориентации и составляет порядка 8 нм. Для изучения влияния размера и формы синтезированы золотые и серебряные наночастицы сферической, вогнутой и параллелепипедной формы с плазмонными резонансами в диапазоне от 400 до 1000 нм. Экспериментально установлено, что наночастицы в биологических средах подвержены агрегации. Это снижает оптическую плотность и изменяет спектральное положение плазмонного резонанса в первые 4 часа инкубации. Наилучшую стабильность оптических свойств продемонстрировали золотые и серебряные наночастицы, полученные методом лазерной абляции, спустя 4 часа в питательной среде. Однако даже в этих случаях агрегация сохраняется, что необходимо учитывать при исследовании взаимодействия с клетками. Разработан метод анализа СЭМ-изображений металлических наночастиц сложной формы с использованием глубокого машинного обучения. Дообучена сегментационная модель SAM 2.1, что позволяет автоматически разметить изображения. На основе сегментационных масок вычислены характеристики наночастиц, такие как средний размер, эксцентриситет и расстояния между центрами. Эти данные могут быть использованы для связи с экспериментальными спектрами металлических наночастиц и разработки наночастиц с заданными оптическими свойствами.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Полученные результаты обладают значительным потенциалом для внедрения инновационных нано- и микросенсоров с оптическими резонансами, работающими в широкой спектральной области. Эти сенсоры могут быть использованы для глубокой диагностики и мониторинга биологических процессов и живых систем, таких как клеточные взаимодействия, механизм поглощения наночастиц и их распределение в живых организмах (in vitro). Применение таких сенсоров позволяет более точно и эффективно отслеживать биохимические реакции, улучшая качество диагностики и терапии в медицине, особенно в области онкологии, нейробиологии и инфекционных заболеваний. Кроме того, эти разработки могут стать основой для создания новых типов высокочувствительных сенсоров для экологического мониторинга, диагностики загрязнений и анализа качества окружающей среды. Внедрение данных технологий может привести к созданию новых продуктов и усовершенствованию существующих, таких как более эффективные диагностические устройства, системы мониторинга и аналитические приборы. Что касается применения данных результатов в производственных технологиях, они могут стать ключевым элементом для усовершенствования методов производства высококачественных и высокочувствительных оптических сенсоров, что позволит повысить точность и чувствительность аналитических приборов, используемых в различных отраслях, от медицины до экологии. Эти достижения в области нанофотоники могут существенно способствовать экономическому росту и социальному развитию Российской Федерации, обеспечивая технологический прорыв и укрепление позиций отечественных компаний на мировом рынке.