Разработка методов контроля оксигенации опухолей и повышения эффективности фотодинамической терапии при помощи метиленового синего

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-72-10117

НазваниеРазработка методов контроля оксигенации опухолей и повышения эффективности фотодинамической терапии при помощи метиленового синего

Руководитель Поминова Дарья Вячеславовна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 02 - Физика и науки о космосе; 02-304 - Спектроскопия

Ключевые слова спектроскопия, фотодинамическая терапия, фотосенсибилизаторы, оксигенация, метиленовый синий, импульсно-периодическое лазерное возбуждение, опухолевое микроокружение

Код ГРНТИ29.31.26

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Онкологические заболевания признаны социально-значимыми, и борьба с ними входит в перечень приоритетов развития медицины Российской Федерации. Поиск новых подходов для лечения онкологических заболеваний остается одним из самых востребованных направлений исследований в современной медицине. Традиционные методы терапии направлены непосредственно на разрушение опухоли. Однако, согласно последним литературным данным, большую роль в процессе развития и прогрессии опухолей играют клетки опухолевого микроокружения, в частности иммунокомпетентные клетки, такие как макрофаги, а также стромальные клетки опухоли (эндотелиальные клетки, фибробласты и др.). Все большую актуальность приобретают опосредованные методы терапии, направленные на коррекцию функционального состояния опухолевого микроокружения и переориентацию иммунокомпетентных клеток на подавление опухолевого роста. Перспективной в этом направлении является фотодинамическая терапия (ФДТ). ФДТ является многофакторным воздействием, влияющим как на клетки опухоли, так и на клетки опухолевого микроокружения, в частности иммунокомпетентные клетки. Уникальность биологического действия ФДТ обусловлена индукцией повреждений биологических структур под действием активных форм кислорода - природных регуляторов клеточной пролиферации, метаболизма и апоптоза. Одной из нерешенных проблем ФДТ является воздействие на опухоли, находящиеся в состоянии гипоксии, например на многие опухоли предстательной и поджелудочной железы. В то же время, гипоксия влияет на состав опухолевого микроокружения, в частности, пониженное содержание кислорода в тканях способствует дифференцировке клеток моноцитарного ряда в противовоспалительное опухоль-ассоциированное состояние, в котором они способствуют прогрессии и метастазированию опухоли. Повышенное содержание кислорода, напротив, способствует увеличению популяции противоопухолевых провоспалительных макрофагов. В связи с этим, большой интерес для повышения эффективности ФДТ представляет развитие новых подходов, которые позволят корректировать функциональное состояние опухоли и метаболизм ее микроокружения посредством контроля оксигенации. Перспективным фотосенсибилизатором для исследований в данном направлении является метиленовый синий (МС). МС обладает как фотодинамической активностью (при лазерном облучении), так и окислительно-восстановительными и каталитическими свойствами (в отсутствии света). По литературным данным, МС способен увеличивать потребление кислорода опухолями. Каталитические свойства МС в отношении опухолей обусловлены его взаимодействием с молочной кислотой, которая образуется в результате аэробного гликолиза. Известно также, что МС способен восстанавливать двухвалентное железо в метгемоглобине (окисленная форма гемоглобина, которая неспособна переносить кислород) до трехвалентного состояния, соответствующего нормальному гемоглобину. Сообщается также о положительном влиянии МС на периферический кровоток. При этом МС обладает флуоресценцией в красной части спектра и значительной фотодинамической активностью. Согласно нашим предварительным данным, МС эффективно накапливается в клетках моноцитарного ряда (в частности макрофагах), что дает возможность оказывать на них целевое фотодинамическое воздействие. Целью данного проекта является проекта является разработка методов применения МС и комбинаций МС с фотосенсибилизаторами (ФС) для контроля оксигенации и коррекции микроокружения опухоли. Для достижения этой цели необходимо проведение междисциплинарного исследования, включающего в себя анализ влияния различных факторов (парциального давления кислорода, интенсивности лазерного воздействия, pH, концентрации коферментов) на фотофизические и фотохимические свойства МС, исследование возможности применения МС и комбинаций МС с фотосенсибилизаторами для контроля оксигенации и коррекции микроокружения опухоли, а также использование полученных данных для in vitro и in vivo приложений в аспекте ФДТ. Несмотря на разносторонний потенциал МС, влияние совокупности различных факторов на его фотофизические и фотохимические свойства до сих пор изучено не до конца. Особый интерес представляет исследование этих свойств in vivo в рамках живых организмов, а также изучение возможных синергетических эффектов при применении МС совместно с другими ФС. Понимание фундаментальных основ взаимодействия МС с возбуждающим лазерным излучением, коферментами и биологическим микроокружением позволит создать теоретическую основу для развития применения ФДТ для лечения гипоксических опухолей. Полученные результаты будут иметь большой потенциал для практической реализации, так как значительно повысят эффективность современных методов терапии онкологических заболеваний, в особенности в отношении опухолей в состоянии гипоксии, плохо поддающихся лечению.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Поминова Дарья В., Рябова Анастасия В., Козликина Елизавета И., Скобельцин Алексей С., Романишкин Игорь Д. Effect of methylene blue on oxygenation level in mice with Ehrlich solid tumors Saratov Fall Meeting SFM'22 Scientific programm, SFM'22, p.37 (год публикации - 2022)

2. Поминова Д.В., Рябова А.В., Скобельцин А.С., Маркова И.В., Романишкин И.Д., Лощенов В.Б. Spectroscopic study of methylene blue in vivo: effects on tissue oxygenation and tumor metabolism Biomedical Photonics, 12(1), pp. 4-13 (год публикации - 2023)
10.24931/2413-9432-2023-12-1-4-13

3. Д.В. ПОМИНОВА, А.В. РЯБОВА, А.С. СКОБЕЛЬЦИН, И.В. МАРКОВА, И.Д. РОМАНИШКИН СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ И ФОТОХИМИЧЕ-СКИХ СВОЙСТВ МЕТИЛЕНОВОГО СИНЕГО in vitro И in vivo IX Международная конференция «Лазерные, плазменные исследования и технологии» ЛаПлаз-2023: Сборник научных трудов. М.: НИЯУ МИФИ, 2023., с.75 (год публикации - 2023)

4. Поминова Д.В., Рябова А.В., Романишкин И.Д., Маркова И.В., Ахлюстина Е.В., Скобельцин А.С. Spectroscopic study of methylene blue photophysical properties in biological media Biomedical Photonics, Т.12, №2 (год публикации - 2023)

5. Поминова Д.В., Рябова А.В., Скобельцин А.С., Маркова И.В., И. Романишкин И.Д. The use of methylene blue to control the tumor oxygenation level 18th International Photodynamic Association World Congress, 18th International Photodynamic Association World Congress Book of abstracts (год публикации - 2023)

6. Поминова Д.В., Рябова А.В., Романишкин И.Д., Маркова И.В., Ахлюстина Е.В., Скобельцин А.С. Study of methylene blue interaction with cell membranes: influence on the mechanism of the photodynamic activity International conference Advanced Laser Technologies ALT`23 Book of abstract, B-O-17, p.131 (год публикации - 2023)

7. Поминова Д.В., Рябова А.В., Cкобельцин А.С., Маркова И.В., Романишкин И.Д. Исследование возможностей применения метиленового синего для контроля оксигенации и метаболизма опухоли Biomedical Photonics, Том 12, № 4s, с.30 (2023) Материалы XII Международного конгресса «Фотодинамическая терапия и фотодиагностика», 2023 г., Москва (год публикации - 2023)

8. Поминова Д.В., РябоваА.В., Скобельцин А.С., Маркова И.В., Романишкин И.Д., Куличенко А.М., Ахлюстина Е.В. Спектроскопическое исследование метиленового синего в водных растворах солей, белков и липидов Тезисы докладов Пятой международной конференции "Физика - наукам о жизни" со школой молодых ученых., Тезисы докладов Пятой международной конференции "Физика - наукам о жизни" со школой молодых ученых. - Спб.: ФТИ им. А.Ф. Иоффеб 2023. - с. 21. (год публикации - 2023)

9. Поминова Д.В., Рябова А.В., Скобельцин А.С., Маркова И.В., Романишкин И.Д. Study of photophysical and photochemical properties of methylene blue in biological media using modern spectroscopic methods Международная научная конференция «Инновационные технологии ядерной медицины и лучевой диагностики и терапии» Сборник тезисов, с. 86-87 (год публикации - 2023)

10. Дарья Поминова, Анастасия Рябова, Алексей Скобельцин, Инесса Маркова, Кирилл Линьков, Игорь Романишкин The use of methylene blue to control the tumor oxygenation level Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, Volume 46, April 2024, 104047 (год публикации - 2024)
10.1016/j.pdpdt.2024.104047

11. Макаров В.И., Скобельцин А.С., Аверчук А.С., Бердников А.К., Чиненкова М.В., Салмина А.Б., Лощенов В.Б. Effect of Photodynamic Therapy with the Photosensitizer Methylene Blue on Cerebral Endotheliocytes In Vitro Photonics, 11(4), 316 (год публикации - 2024)
10.3390/photonics11040316

12. Поминова Д.В., Рябова А.В., Скобельцин А.С., Маркова И.В., Романишкин И.Д. Photodynamic Therapy with Methylene blue and Chlorin E6 Photosensitizers: study on Ehrlich carcinoma mice model Biomedical Photonics, 13(2), 9-18. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.24931/2413-9432-2024-13-2-9-18

13. Д.В. Поминова, А.В. Рябова, И.Д. Романишкин, И.В. Маркова, А.С. Скобельцин Влияние фотодинамической терапии с метиленовым синим и хлорином е6 на метаболизм опухоли in vivo на мышиных моделях Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНЫ» (год публикации - 2024)

14. Поминова Д.В., Рябова А.В., Скобельцин А.С., Маркова И.В., Романишкин И.Д. Спектроскопическое исследование взаимодействия метиленового синего с коферментами и его влияния на метаболизм опухоли Современные технологии в медицине, том 17, номер 1, стр. 18. (год публикации - 2025)
10.17691/stm2025.17.1.02

15. Рябова А.В., Романишкин И.Д., Маркова И.В., Поминова Д.В. Одновременное применение двух фотосенсибилизаторов — метиленового синего и хлорина е6: исследование на культуре клеток Современные технологии в медицине, том 17, номер 1, стр. 58. (год публикации - 2025)
10.17691/stm2025.17.1.06

16. Поминова Д.В., Рябова А.В., Маркова И.В., Скобельцин А.С., Романишкин И.Д. Spectroscopic study of methylene blue to the leucomethylene blue transition in vitro and in vivo 31st International Conference on Advanced Laser Technologies Book of Abstracts (год публикации - 2024)

17. А.В. Рябова, Д.В. Поминова, И.В. Маркова, И.Д. Романишкин, В.Б. Лощенов Effect of methylene blue on the NADH metabolic index of tumor cells before and after PDT 31st International Conference on Advanced Laser Technologies Book of Abstracts (год публикации - 2024)

18. Д.В. Поминова, А.В. Рябова, А.С. Скобельцин, И.В.Маркова, И.Д. Романишкин The combined use of methylene blue and chlorin E6 photosensitizers for photodynamic therapy and correction of the tumor microenvironement IEEE Xplore 2024 International Conference Laser Optics (ICLO) (год публикации - 2024)
10.1109/ICLO59702.2024.10624192

19. А.В. Рябова, И.Д. Романишкин, И.В. Маркова, Д.В. Поминова Влияние метиленового синего на клеточный метаболизм и сенсибилизацию вторым фотосенсибилизатором хлорином е6 Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНЫ» (год публикации - 2024)

20. Инесса Маркова, Анастасия Рябова, Игорь Романишкин, Дарья Поминова Study of methylene blue photodynamic activity on erythrocyte suspensions in vitro Biomedical Photonics (год публикации - 2025)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках третьего года реализации проекта проведены комплексные исследования фармакокинетических, фотофизических и фармакодинамических характеристик комбинации фотосенсибилизаторов — метиленового синего (МС) и хлорина е6 — в контексте оптимизации фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. Основной целью работы являлось изучение синергетического эффекта комбинации данных соединений для коррекции метаболизма опухолевой ткани, повышения её оксигенации и усиления терапевтической эффективности ФДТ. На третьем этапе исследований выполнены эксперименты in vivo на мышиных моделях опухолей. Разработана и апробирована видеофлуоресцентная методика для мониторинга накопления фотосенсибилизаторов и оксигенации тканей в режиме реального времени. Исследование фармакокинетики МС и хлорина е6 проводилось с применением спектроскопических методов, включая возбуждение флуоресценции лазерами с длинами волн 632,8 нм (для МС) и 405 нм (для хлорина е6). Для количественной оценки концентраций ФС в применяли декомпозицию спектров и использовали калибровончные кривые, полученные при помощи фантомов биологических тканей. Полученные данные легли в основу алгоритма расчета концентраций ФС в органах и тканях и скорости фобообесцвечивания, учитывающего вклад МС и хлорина е6 в интегральную флуоресценцию. Установлено, что при одновременном введении комбинации фотосенсибилизаторов максимальное накопление МС в опухоли регистрируется через 20 минут, тогда как пиковая концентрация хлорина е6 достигается через 1 час. При раздельном введении интенсивность флуоресценции МС в первые 20 минут превышает показатели комбинированного введения, однако через 1 час после инъекции наблюдается обратная зависимость: при совместном введении флуоресценция МС увеличивается вследствие ингибирования его превращения в лейкоформу. Механизм данного явления обусловлен подавлением хлорином е6 окислительного фосфорилирования и снижением уровня NADH и FADH2 в опухолевой ткани. Результаты коррелируют с данными in vitro, где продемонстрировано замедление восстановления МС в лейкоформу при инкубации хлорином е6. Важным аспектом работы стало изучение динамики оксигенации опухолевой ткани под воздействием комбинированной терапии. Метод регистрации спектров обратного диффузного рассеяния биотканей в диапазоне 500–600 нм позволил количественно оценить изменение уровня оксигенации в зависимости от режима введения фотосенсибилизаторов. Установлено, что предварительное введение МС (10 мг/кг) за 5 дней до ФДТ хлорином е6 приводит к увеличению оксигенации опухоли относительно контрольной группы. Наибольший эффект зафиксирован при пероральном введении МС. Этот феномен объясняется метаболическим переключением опухолевых клеток с гликолиза на OXPHOS, что подтверждено FLIM-микроскопией NADH. Анализ фазорных диаграмм флуоресценции выявил увеличение среднего времени жизни NADH в группах с предварительным введением МС, что соответствует переходу к окислительному фосфорилированию. На гистологических срезах опухолей после ФДТ наблюдается апоптоз. При внутривенном введении МС зарегистрировано формирование зон некроза, сопровождающееся накоплением продуктов перекисного окисления липидов (по времени жизни флуоресценции NADH). Установлено, что комбинация МС и хлорина е6 не только повышает оксигенацию опухоли, но и модулирует фотодинамические процессы: скорость дезоксигенации гемоглобина снижается при совместном введении ФС. При этом фотобличинг хлорина е6 усиливается благодаря образованию долгоживущих активных форм кислорода через МС. Терапевтическая эффективность ФДТ с комбинацией ФС оценена по динамике роста опухоли и гистологическим изменениям. Применение протокола с пероральным введением МС в течение 5 дней до ФДТ хлорином е6 (5 мг/кг, 660 нм, 200 мВт/см², 60 Дж/см²) обеспечило снижение объёма опухоли в группах, получавших предварительную терапию с МС перорально и внутрибрюшинно относительно контроля. Внутривенное введение демонстрировало менее выраженный эффект предположительно из-за развития локального тромбоза. Иммуногистохимический анализ срезов опухолей выявил увеличение экспрессии маркеров CD68 и CD163 после ФДТ, что свидетельствует об активации провоспалительного ответа и ангиогенеза. Одновременно зарегистрировано повышение уровня MERTK— рецептора, ассоциированного с иммуносупрессией, что требует дальнейшего изучения для оптимизации схем терапии. Отдельным направлением работы стала разработка и валидация видеофлуоресцентной системы для одновременной оценки накопления фотосенсибилизаторов и оксигенации тканей in vivo. Конструкция установки включает поворотный держатель фильтров Holmarc MFW-2 с набором узкополосных интерференционных фильтров (538/10, 556/10, 584/10, 596/10, 710/40 нм), КМОП-камеру Ximea MQ013RG-E2 и программный комплекс для спектрального анализа. Система позволяет регистрировать флуоресценцию ФС и оксигенацию по соотношению поглощения оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина. Апробация методики на мышиных моделях опухолей подтвердила её чувствительность к изменениям концентрации фотосенсибилизаторов в диапазоне 0,1–5 мг/кг и возможность детектирования колебаний оксигенации при прогрессии опухоли. Результаты исследования вносят существенный вклад в понимание механизмов синергии фотосенсибилизаторов с различными метаболическими мишенями. Разработанная видеофлуоресцентная система открывает возможности для персонализированного подхода в ФДТ, позволяя корректировать параметры облучения в зависимости от реального распределения препаратов и оксигенации. Полученные результаты создают основу для клинических испытаний комбинированной терапии с использованием метаболически активных фотосенсибилизаторов.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты данного проекта имеют значительный потенциал для практического применения в экономике и социальной сфере Российской Федерации. Разработанные подходы к комбинированной фотодинамической терапии (ФДТ) с использованием метиленового синего (МС) и хлорина е6 могут быть внедрены в клиническую практику для лечения злокачественных опухолей, включая устойчивые к традиционной терапии формы. Это позволит снизить затраты на лечение за счет уменьшения необходимости в дорогостоящих таргетных препаратах и лучевой терапии, а также сократит сроки реабилитации пациентов. Кроме того, использование МС, который является относительно недорогим и доступным соединением, делает предложенную методику экономически выгодной для российского здравоохранения. Разработанная видеофлуоресцентная система мониторинга накопления фотосенсибилизаторов и оксигенации тканей может быть коммерциализирована как медицинское оборудование, что создаст предпосылки для развития отечественного производства высокотехнологичных диагностических устройств. В социальной сфере внедрение результатов проекта способно улучшить качество жизни онкологических пациентов за счет снижения токсичности лечения и повышения его эффективности. Методика коррекции метаболизма опухолей с помощью МС особенно актуальна для пациентов с гипоксическими новообразованиями, которые плохо поддаются стандартной терапии. Это открывает новые возможности для лечения агрессивных форм рака, что соответствует приоритетам государственной политики в области здравоохранения. Кроме того, разработка новых протоколов ФДТ с использованием отечественных фотосенсибилизаторов снизит зависимость от импортных препаратов, что важно в условиях санкционного давления и необходимости обеспечения лекарственной безопасности страны. С точки зрения научно-технологического задела, проект способствует развитию персонализированной медицины и созданию инновационных терапевтических платформ на основе комбинации фотосенсибилизаторов. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований в области онкологии, биофотоники и медицинского приборостроения, что укрепит позиции России в этих высокотехнологичных областях. Коммерциализация разработок, включая новые фотосенсибилизирующие композиции и системы визуализации, может стать основой для создания стартапов или сотрудничества с фармацевтическими и биотехнологическими компаниями. Это не только внесет вклад в экономический рост, но и поможет формированию кадрового потенциала в области трансляционной медицины и биомедицинской инженерии.