Применение методов идентификации ДНК в водной среде (eDNA) для мониторинга видового разнообразия и численности водоплавающих птиц

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10043

НазваниеПрименение методов идентификации ДНК в водной среде (eDNA) для мониторинга видового разнообразия и численности водоплавающих птиц

Руководитель Демин Александр Геннадьевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" , г Санкт-Петербург

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-210 - Молекулярная генетика

Ключевые слова экологическая ДНК, секвенирование, ДНК-штрихкодирование, метабаркодирование, водоплавающие птицы, ПЦР, мтДНК, экологический мониторинг, экологическая генетика, митохондриальная ДНК, гены рибосомной РНК

Код ГРНТИ34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В настоящее время биологическое разнообразие и численность птиц, связанных с водными и околоводными экосистемами, оценивается с помощью классических методов прямого визуального наблюдения, идентификации и учёта. Естественными факторами, ограничивающими эффективность такого подхода, являются погодные условия, длина светового дня, а также лимит числа наблюдателей и времени наблюдений. Новым инструментом, потенциально способным расширить возможности мониторинга биоразнообразия водных экосистем, стал анализ так называемой экологической или средовой ДНК (eDNA) в воде. Метод основан на детекции и анализе внеклеточной ДНК или ДНК клеточного дебриса, которая попадает в окружающую среду в результате секреции живых организмов или со слущивающимися клетками и производными кожи. Идентификация видов осуществляется по наличию видоспецифичных фрагментов ДНК, широко используемых для ДНК-штрихкодирования видов (гены митохондриальной ДНК, гены и спейсеры рибосомных повторов ядерной ДНК). При этом концентрация видоспецифичной ДНК в воде коррелирует с численностью особей данного вида. Подобный подход может быть использован как для выявления eDNA конкретных известных видов методом ПЦР в реальном времени, так и для изучения всего разнообразия организмов определенной таксономической группы – метабаркодирование, основанное на методах высокопроизводительного секвенирования. В мировой практике метод оценки биоразнообразия с помощью анализа видоспецифичной eDNA начал использоваться относительно недавно и позволил получить интересные результаты при исследовании видового разнообразия рыб, беспозвоночных и китообразных. Первые работы, направленные на изучение возможности мониторинга птиц с использованием метода eDNA начались только в 2018 году. К настоящему времени количество исследований, связанных с изучением eDNA птиц (в том числе в комплексе с другими таксонами позвоночных) крайне мало. Исследования в этой области находятся на начальном этапе и пока затрагивают преимущественно общие методические вопросы. Предлагаемый проект направлен на апробирование и продвижение метода анализа eDNA в водной среде для изучения биоразнообразия водоплавающих и околоводных птиц. Этот метод может стать мощным инструментом биомониторинга орнитофауны северных регионов, в значительной степени представленной такими видами. Применение eDNA актуально для выявления мест миграционных стоянок водоплавающих птиц, которые носят временный характер и сложны в обнаружении без использования трудоёмких и ресурсозатратных стационарных визуальных наблюдений. Использование этого метода перспективно и для мониторинга редких и малочисленных видов птиц, регистрация присутствия которых визуальными методами часто носит случайный, субъективный характер и не способна отобразить динамику численности их популяций, а также вклад в биоразнообразие экосистемы. Предлагаемый подход может быть использован не только в комплексе с классическими методами учёта птиц, но и в качестве самостоятельного инструмента мониторинга. Это позволит существенно сократить время работ, повысить их качество и значительно снизить финансовые затраты на исследования, что особенно актуально для реализации программ многолетнего экологического мониторинга в труднодоступных северных регионах, где в последние годы наблюдается стремительное развитие нефтегазовых и инфраструктурных проектов. В настоящем Проекте изучение возможностей и границ применения методов анализа eDNA для видовой идентификации и количественной оценки перелетных водоплавающих птиц будет выполнено на примере орнитофауны миграционных стоянок в Свирской губе Ладожского озера. В исследовании запланированы: поиск оптимальных способов забора и фильтрации образцов воды для концентрирования образцов eDNA; изучение скорости деградации eDNA птиц в природных водоемах; разработка тест-систем, основанных на методе ПЦР в реальном времени, для видовой идентификации наиболее массовых водоплавающих птиц арктического региона, мигрирующих через Ладожское озеро; разработка оптимальной панели праймеров для избирательного метабаркодирования eDNA птиц; регулярный отбор образцов воды со стационарных точек в акватории Свирской губы на протяжении всего периода миграции птиц весной и осенью 2023, 2024 годов; анализ отобранных образцов методом количественной ПЦР в реальном времени (для детекции eDNA известных массовых видов птиц) и методами высокопроизводительного секвенирования (для избирательного метабаркодирования eDNA птиц). Также будет проводиться сопутствующий визуальный учет видового состава и численности птиц на акватории проведения работ со стационарных наблюдательных пунктов, необходимый для оценки достоверности данных, полученных при анализе eDNA. Полученные в ходе реализации проекта данные позволят определить период присутствия в воде фрагментов eDNA птиц, длина которых достаточна для проведения видовой идентификации. Параллельно будут изучены оптимальные способы забора и концентрирования eDNA птиц из образцов воды. Будут разработаны и апробированы праймеры для видоспецифичной детекции eDNA массовых видов водоплавающих птиц арктической зоны, мигрирующих через Ладожское озеро, и получены данные о представленности и концентрации в отобранных образцах (весна и осень 2023, 2024 годов) последовательностей eDNA видов-мишеней. Будет разработана панель праймеров для наиболее информативного метабаркодирования eDNA птиц. Выполнены секвенирование ДНК-библиотек, полученных из образцов eDNA, собранных в 2023 – 2024 годах, технологиями Oxford Nanopore и Illumina и последующая биоинформатическая обработка данных. Полученные результаты молекулярно-генетических исследований будут сопоставлены с результатами прямых визуальных наблюдений, а также данными многолетней статистики. Будет проведена оценка эффективности и ограничений применения различных методов анализа eDNA (ПЦР в реальном времени, высокопроизводительное секвенирование Oxford Nanopore и Illumina) для регистрации биоразнообразия и относительной численности водоплавающих птиц арктической зоны на миграционных стоянках в акватории Свирской губы. На основе полученных результатов будет разработана концепция экологического мониторинга водоплавающих птиц, опирающаяся на использование метода eDNA.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Демина И.В., Ильина А.В., Стриков Д.А., Срипниченко, А.Ю. Галкина С.А., Демин А.Г. Visual observations of waterfowl as a basis for validating the environmental DNA method for monitoring bird diversity VII International Eurasian Ornithology Congress, 18-21 October 2023, Izmir, Türkiye, Abstract Book, Poster 23, Conference: VII International Eurasian Ornithology Congress, 18-21 October 2023, Izmir, Türkiye, Abstract Book, Poster 23 (год публикации - 2023)

2. Ильина А.В., Демин А.Г., Галкина С.А., Сахабеев Р.Г. Анализ динамики деградации ДНК в воде ладожского озера при разных температурных режимах Сборник тезисов XIV научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых имени профессора, Лауреата Государственной премии СССР А.С. Дудырева., С 421. (год публикации - 2024)

3. Галкина С., Демина И., Платонова Е., Демин А. Aquatic environmental DNA: applications for assessment and monitoring vertebrate diversity Biological Communications (год публикации - 2024)

4. Ильина А.В. , Галкина С.А., Стариков Д.А. Сахабеев Р.Г., Демин А.Г. Анализ динамики деградации эДНК в воде Ладожского озера Биотехнология, том 40, № 3, с. 100–108 (год публикации - 2024)
10.56304/S0234275824030116

5. Демин А.Г., Галкина С.А., Такки О.Д., Скрипниченко А.Ю., Иванов С.Д., Петров С.А. Изучение биоразнообразия птиц с помощью методов, основанных на меташтрихкодировании свободной ДНК в водной среде Материалы XVI Международной орнитологической конференции Северной Евразии Казань. Казань: Редакционно-издательский центр «Школа», С. 70-71. (год публикации - 2025)

6. Скрипниченко А.Ю., Галкина С.А., Такки О.Д., Стариков Д.А., Демин А.Г. Свободная ДНК в воде как инструмент регистрации скрытого видового разнообразия водоплавающих птиц (на примере исследования нижнего течения р. Свирь) Материалы XVI Международной орнитологической конференции Северной Евразии Казань. Казань: Редакционно-издательский центр «Школа», С. 228-229 (год публикации - 2025)

7. Галкина С.А., Ильина А.В., Такки О.Д., Сахабеев Р.Г., Демин А.Г. ДНК трех стихий: развитие методов молекулярного-генетического анализа в экологических исследованиях Природа, №2 (1314). С. 3-18. (год публикации - 2025)
10.7868/S0032874X2502001X

8. Галкина С.А., Демина И.В., Платонова Е.В., Такки О.Д., Демин А.Г. ДНК окружающей среды как инструмент изучения видового разнообразия и экологии птиц Труды Зоологического института Российской Академии наук, T. 104. №2 (год публикации - 2025)

9. Демин А.Г., Галкина С.А., Ильина А.В., Стариков Д.А., Скрипниченко А.Ю., Такки О.Д. Изучение биоразнообразия водоплавающих птиц с помощью методов, основанных на детекции свободной ДНК в водной среде Сборник тезисов международного Конгресса «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300‑летию российской науки и высшей школы». Саратов, 14–19 июня 2024 года, 2024 Издательский дом «Петрополис», Санкт‑Петербург, 2024. , с. 81 (год публикации - 2024)

10. Романенко С.А., Прокопов Д.Ю., Марченко С.А., Кулак М.М., Ильина А.В., Сердюква Н.А., Галкина С.А., Трифонов В.А. In situ and in silico localization of major satellite DNAs in the genome of the red-eared slider (Trachemys scripta elegans, Emydidae, Testudines) Cytogenetic and Genome Research, https://doi.org/10.1159/000544908 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.1159/000544908

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Для создания ДНК-библиотек и тестирования технологии эДНК-метабаркодирования были разработны универсальные праймеры COI-AV к гену COI митохондриальной ДНК птиц и MiVert к гену 12S рРНК митохондриальной ДНК позвоночных. Данные маркеры могут быть одинаково эффективно использованы для создания и секвенирования ДНК-библиотек с использованием различных технологий, что делает их универсальным инструментом ДНК метабаркодинга в различных лабораторных условиях. С целью мультиплексированния ДНК-библиотек для нанопорового секвенирования последовательности праймеров были модифицированы путем включения в их 5’-концевые области адаптеров Oxford Nanopore Technologies (ONT). Протестированы различные протоколы амплификации для увеличения выхода ПЦР-продуктов с использованием «хвостатых» праймеров. Показано, что двухэтапная амплификация с последовательным использованием немодифицированных и «хвостатых» праймеров MiVert увеличивает точность реакции и выход ПЦР-продуктов. Были протестированы наборы реагентов для ПЦР отечественного производства. Taq-полимераза (Евроген) продемонстрировала наиболее высокую избирательность ПЦР с минимальным кол-вом неспецифических продуктов. Фьюжн полимераза 2.0 (Биолабмикс) продемонстрировала наибольшую чувствительность и процессивность в том числе при работе с матрицами контаминированными гуминовыми кислотами. Для тестирования технологии эДНК-метабаркодирования было использовано 72 образца эДНК из воды и 52 образца эДНК из полевых отрицательных контролей, отобранных в Ладожском озере, р. Свирь, Охотском море, Куршском и Финском заливах Балтийского моря и Карском море. С использованием праймеров MiVert-ONT и набора реагентов 5х-qPCR-HS успешно получены ампликоны из всех 7 образцов эДНК, отобранных в Охотском море. Качественные ампликоны также удалось получить с использованием образцов эДНК из р. Свирь и набора реагентов Фьюжн полимераза 2.0 (праймерами MiVert амплифицировано 14 образцов эДНК; праймерами COI-AV амплифицировано 16 образцов эДНК). 15 сентября 2024 года были дополнительно отобраны пробы воды из реки Свирь (отбор выполнялся в тех же точках, в которых пробы отбирались весной). В данный период присутствие птиц на водоеме было минимальным, что позволяло проанализировать вероятность контаминации образцов эДНК из воды генетическим материалом птиц из донных отложений. Полученные образцы воды были обработаны аналогично образцам, собранным на р. Свирь весной. В результате, удалось амплифицировать 9 образцов эДНК с использованием праймеров MiVert и 16 образцов эДНК с использованием праймеров COI-AV. Все полученные ампликоны были очищены с использованием магнитных частиц, индексированы с использованием набора PCR Barcoding Expansion 1-96 kit (ONT, Великобритания) и объединены в две ДНК-библиотеки – полученную с помощью праймеров MiVert и COI-AV соответственно. Подготовка ДНК-библиотек для секвенирования выполнялась с использованием набора Ligation Sequencing Kit V14 (ONT, Великобритания) и набора лигаз Companion Module for ONT Ligation Sequencing (New England Biolabs, США). Секвенирование выполнялось с использованием генетического анализатора MinION (ONT) на проточной ячейке R10.4.1 (ONT, Великобритания). Последующие операции c сырыми прочтениями выполнялись в пакете программ Geneious Prime. Были подготовлены локальные базы референсных последовательностей гена 12S рРНК позвоночных и COI птиц. Таксономическую идентификацию проводили методом картирования на референс. Подробное описание этапов обработки данных и анализа результатов изложено см. http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.5197561. Было секвенировано и проанализировано 48 баз данных (COI-AV+MiVert), относящихся к р. Свирь (NCBI, SRA - BioProject: PRJNA1261048), и 7 баз данных, относящихся к Охотскому морю (NCBI, SRA - BioProject: PRJNA1238853). При отборе проб в Охотском море и на реке Свирь выполнялись попутные учеты птиц. В Охотском море в районах пробоотбора было учтено 30 видов. Методом эДНК-метабаркодирования с использованием праймеров MiVert в 7 образцах воды зарегистрирован генетический материал 5 видов птиц, три из которых были наиболее многочисленными по результатам визуальных учетов. Большинство определений пришлось на дальневосточные и тихоокеанские виды рыб (54 вида), также отмечено 4 вида морских млекопитающих. На р. Свирь весной в ходе попутных наблюдений зарегистрировано 17 видов птиц. В ходе осеннего пробоотбора птицы на воде зарегистрированы не были. Анализ эДНК из 17 образцов воды, собранных весной в период массовой миграции птиц, с использованием праймеров MiVert и COI-AV позволил зарегистрировать 20 видов птиц, из которых 9 наиболее многочисленных видов были также отмечены визуально. В осенних образцах воды обнаружен генетический материал лишь трех видов птиц. Суммарно из 97 водоплавающих и околоводных видов птиц, зарегистрированных в регионе проведения работ на р. Свирь, по результатам учетов 2023 г. с помощью эДНК удалось выявить 16 видов. Для изучения перспектив использования эДНК при проведении мониторинговых исследований в Арктике в июле-августе 2024 г. были организованы сборы образцов воды и визуальные учеты птиц в прибрежных районах и на островах Печорского моря, а также вдоль западного побережья п-ва Ямал в Карском море. Отобрано 37 образцов воды и 21 полевая отрицательная проба. C использованием праймеров MiVert был секвенирован и проанализирован 21 образец воды, с использованием праймеров COI-AV секвенировано и проанализировано 28 образцов воды. Полученные базы сырых прочтений депонированы в NCBI, SRA – BioProject: PRJNA1261075. С использованием праймеров MiVert в образцах воды удалось зарегистрировать 17 видов птиц, 32 вида рыб и 4 вида морских млекопитающих, с использованием праймеров COI-AV - 27 видов птиц. В ходе учетов на островах Матвеев, Голец и Долгий зарегистрировано 29 видов птиц. По эДНК удалось определить 20 птиц до уровня вида и еще 4 до уровня рода. Общими для двух методик оказались определения 12 наиболее многочисленных видов водоплавающих и околоводных птиц. Отметим, что короткие маркеры в сочетании со скудными данными о гаплотипическом разнообразии птиц региона не позволили дифференцировать виды белоголовых чаек и некоторых гусеобразных. Дальнейшее совершенствование методики, в частности увеличение глубины секвенирования ДНК-библиотек, длины маркеров и полноты референсных баз данных, бесспорно, уменьшит существующий разрыв. Но уже сегодня мы можем рассматривать эДНК в качестве рабочего инструмента для мониторинга биоразнообразия авифауны в Арктике.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Применение метода эДНК-метабаркодирования позволит увеличить производительность и точность исследований биоразнообразия позвоночных в труднодоступных северных регионах страны, где использование классических методов визуального мониторинга сопряжено с высокими финансовыми затратами и логистическими проблемами.