Обратимое фосфорилирование белков тилакоидных мембран как мишень для повышения устойчивости высших растений к факторам среды

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10088

НазваниеОбратимое фосфорилирование белков тилакоидных мембран как мишень для повышения устойчивости высших растений к факторам среды

Руководитель Ветошкина Дарья Васильевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» , Московская обл

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые слова фотосинтез, адаптация, устойчивость, высшие растения, обратимое фосфорилирование белков, светособирающая антенна, фотосистема 1, фотосистема 2

Код ГРНТИ34.31.17

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Обратимое фосфорилирование белков светособирающего комплекса фотосистемы 2 (ССК2) играет важную роль в адаптации растений к условиям освещения – ключевого фактора для функционирования фотосинтезирующих организмов; реакции фосфорилирования/дефосфорилирования при этом осуществляют фермент киназа STN7 и фосфатаза TAP38/PPH1, соответственно. Фосфорилирование белков Lhcb1 и Lhcb2 ССК2 приводит к отстыковке периферической части ССК2, содержащей эти белки, от фотосистемы 2 и связыванию ССК2 с фотосистемой 1, что балансирует таким образом работу обеих фотосистем. Данный защитный механизм представляет собой краткосрочную адаптацию фотосинтетического аппарата и запускается при переходе от ночного к дневному периоду или изменении спектрального состава света и называется в англоязычной литературе state transitions, т.е. переходы состояний. Максимальное развитие данного процесса, как показано, происходит после 20-ти минут освещения. Долгосрочная адаптация на уровне ССК2 в ответ на изменение уровня освещенности заключается в изменении размера ССК2, в частности, при повышенном освещении происходит уменьшение размера этой антенны путем прекращения биосинтеза белков Lhcb1, Lhcb2, Lhcb3 и Lhcb6, что способствует защите фотосистемы 2 от фотоингибирования. Данный тип адаптации запускается при более длительном действии света, от 1-го до нескольких дней. Ключевую роль в обеих адаптациях, как было показано, играет фермент STN7 киназа, при этом одним из необходимых условий для работы киназы является наличие АТФ в хлоропласте. Сложившаяся к настоящему времени картина выглядит парадоксальной: фосфорилирование белков Lhcb1 и Lhcb2 и сам процесс state transitions происходят только в условиях низкой освещенности, но не в условиях повышенной освещенности, когда АТФ в хлоропласте накапливается в значительном количестве, что является благоприятным условием для протекания state transitions. Ингибирование процесса state transitions при высокой интенсивности света наводит на мысль о другом механизме участия фермента STN7 киназы в долгосрочной адаптации, не связанном со state transitions, и о возможном ее включении в сигнальные пути в этих условиях. Кроме того, уровень фосфорилированных белков зависит не только от функционирования киназы, но и от функционирования фосфатазы TAP38/PPH1. Однако до сих пор не установлены факторы, влияющие на активность фосфатазы TAP38/PPH1, участвующей в дефосфорилировании белков антенны фотосистемы 2, и не изучена роль этой фосфатазы на ярком свету. Научной проблемой, на решение которой направлен данный проект, является исследование взаимосвязи краткосрочной и долгосрочной адаптации фотосинтетического аппарата к измененным условиям освещенности. Основной научной идеей проекта является интеграция обратимого фосфорилирования белков ССК2 в кратковременную и долговременную адаптацию к действию света. Более того, литературные и наши данные показывают, что STN7 киназа может являться ферментом, активность которого обеспечивает не только адаптацию растений к действию света, но и к другим факторам среды, а именно к изменению концентрации диоксида углерода в воздухе. В связи с этим, в ходе реализации проекта будет также изучена роль обратимого фосфорилирования при адаптации растений к изменению содержания углекислого газа, как другого основополагающего фактора роста и развития растений, что особенно актуально в связи с климатическими изменениями, наблюдаемы в современном мире. В наших предыдущих работах установлено, что для запуска уменьшения размера антенны фотосистемы 2 при повышении освещенности необходимым компонентом сигнальных путей является пероксид водорода – ключевой сигнальный агент при адаптации растений к различным факторам среды. В ходе реализации проекта предстоит выяснить как пероксид водорода влияет на обратимое фосфорилирование белков антенны фотосистемы 2 и на активность ферментов, участвующих в этом процессе. Для детальной оценки влияния пероксида водорода на функциональную активность STN7 киназы и TAP38/PPH1 фосфатазы, эти ферменты будут выделены и очищены после их гетерологической экспрессии в E. сoli и будет измерена их каталитическая активность при добавке пероксида водорода. Учитывая тот факт, что не только пероксид водорода может влиять на активность ферментов, будет изучено влияние действия других активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион радикал и гидроксильный радикал. Кроме того, необходимо установить, к каким изменениям влияние пероксида водорода или других АФК на тот или иной фермент будет приводить на уровне хлоропластного генома, для чего будут проведены исследования изменений, происходящих в пластоме в изучаемых условиях. Остаётся неизвестным влияние ассоциации фосфорилированных белков светособирающей антенны с фотосистемой 1 на функционирование реакционного центра фотосистемы 1. В литературе нет данных о влиянии фосфорилированных белков на продукцию АФК в фотосистеме 1, однако накапливается информация о важности фосфорилированных белков для защиты фотосистемы 1 от фотоингибирования. В ходе выполнения проекта будут изучены детальные механизмы того, как изменяется функционирование и устойчивость ФС1 в оптимальных и ингибирующих условиях. Исследование представляет собой решение ряда задач, направленных на установление: 1) роли фосфорилированных белков ССК2 в долгосрочной адаптации высших растений к повышенной освещенности; 2) зависимости между количеством пероксида водорода и обратимым фосфорилированием белков ССК2 и процессом state transitions в целом; 3) прямого влияния пероксида водорода и других АФК на функционирование выделенных и очищенных STN7 киназы и TAP38/PPH1 фосфатазы in vitro; 4) роли ассоциации ССК2, содержащего фосфорилированные белки, с фотосистемой 1, в регуляции образования пероксида водорода и других АФК, функционировании фотосистемы 1 и фотосинтетического аппарата в изучаемых условиях; 5) роли обратимого фосфорилирования в адаптации растений к измененному содержанию углекислого газа в воздухе и взаимосвязи между функционированием STN7 киназы, TAP38/PPH1 фосфатазы и уровнем содержания пероксида водорода в этих условиях; 6) влияния повышенной освещенности, приводящей к ингибированию фосфорилирования белков ССК2, на функционирование АТФ-синтазы, образующей субстрат для фосфорилирования белков – АТФ. Таким образом, выполнение данного проекта необходимо для того, чтобы понять, как осуществляются естественные адаптационные перестройки фотосинтетического аппарата при действии факторов среды, что является необходимым шагом для дальнейшего развития стратегии повышения устойчивости организмов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Надеева Е.М., Игнатова Л.К., Руденко Н.Н., Ветошкина Д.В., Найдов И.А., Козулева М.А., Иванов Б.Н. Features of Photosynthesis in Arabidopsis thaliana Plants with Knocked out Gene of Alpha Carbonic Anhydrase 2 Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 12(9), 1763 (год публикации - 2023)
10.3390/plants12091763

2. Д.В. Ветошкина, М.М. Борисова-Мубаракшина Reversible protein phosphorylation in higher plants: focus on state transitions Biophysical Reviews, Т. 15, с. 1079–1093 (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01116-y

3. Дарья Ветошкина, Марина Козулева, Иван Проскуряков, Василий Терентьев, Алексей Бережнов, Илья Найдов, Борис Иванов, Ирина Кленина, Мария Борисова-Мубаракшина Dependence of State Transitions on Illumination Time in Arabidopsis and Barley Plants Protoplasma, 1-11 (год публикации - 2023)
10.1007/s00709-023-01877-z

4. Ветошкина Д.В.*, Проскуряков И.И., Козулева М.А., Терентьев В.В., Бережнов А.В., Найдов И.А., Иванов Б.Н., Борисова-Мубаракшина М.М. СРАВНЕНИЕ STATE TRANSITIONS В АРАБИДОПСИСЕ И ЯЧМЕНЕ I региональное собрание РФО и Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемы фотобиологии и биофотоники» Сборник тезисов. Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2024. – 291 с., стр. 24 - 25 (год публикации - 2024)

5. Надеева Е.М., Ветошкина Д.В., Руденко Н.Н., Игнатова Л.К., Иванов Б.Н. РЕГУЛЯЦИЯ РАЗМЕРА СВЕТОСОБИРАЮЩЕЙ АНТЕННЫ ФОТОСИСТЕМЫ 2 В РАСТЕНИЯХ ARABIDOPSIS THALIANA БЕЗ АЛЬФА-КАРБОАНГИДРАЗЫ 2 I региональное собрание РФО и Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемы фотобиологии и биофотоники» Сборник тезисов. Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2024. – 291 с., стр. 62 - 63 (год публикации - 2024)

6. Балашов Н.В., Маркин Р.В., Ветошкина Д.В., Иванов Б.Н., Борисова-Мубаракшина М.М. ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНТЕННЫ ФОТОСИСТЕМЫ 2 В РАСТЕНИЯХ ЯЧМЕНЯ (HORDEUM VULGARE) В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ И ЗАСУХИ I региональное собрание РФО и Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемы фотобиологии и биофотоники» Сборник тезисов. Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2024. – 291 с., стр. 19 - 20 (год публикации - 2024)

7. Маркин Р.В., Козулева М.А., Иванов Б.Н. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ БИКАРБОНАТА В ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОМ ЭЛЕКТРОННОМ ТРАНСПОРТЕ ПУТЕМ АНАЛИЗА БЫСТРОГО ИЗМЕНЕНИЯ ВЫХОДА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА A ТИЛАКОИДОВ НА СВЕТУ I региональное собрание РФО и Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемы фотобиологии и биофотоники» Сборник тезисов. Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2024. – 291 с. , стр. 57 - 58 (год публикации - 2024)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе работ третьего года проекта было показано, что в растениях дикого типа арабидопсиса уже через 3 часа после повышения освещенности происходит значительное падение уровня экспрессии всех генов хлоропластного генома. В то время как такого падения не наблюдается в растениях с заблокированным синтезом STN7 киназы. Таким образом, показано, что STN7 киназа является необходимым компонентом для быстрого запуска адаптационных перестроек в фотосинтетическом аппарате при возрастании освещенности. Отсутствие STN7 киназы не позволяет растениям запускать те же механизмы, что и растения дикого типа. Получены дополнительные подтверждения ингибирования процесса State transitions при возрастании освещенности пероксидом водорода. В экспериментах этого года на изолированных тилакоидных мембранах использовался эффективный акцептор электронов от ФС1 – метилвиологен (MV), его добавка даже в условиях низкой освещенности приводит к возрастания скорости электронного транспорта в фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ФЭТЦ) и увеличению скорости образования пероксида водорода компонентами ФЭТЦ. Добавка MV приводил к достоверному подавлению накопления Lhcb1 и Lhcb2 фосфорилированных белков. Однако добавка каталазы – фермента, разлагающего пероксид водорода, снимала эффект MV. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирование накопления Lhcb1 и Lhcb2 фосфорилированных белков является пероксид зависимым процессом. В ходе работ по проекту был получен рекомбинантный белок TAP38/PPH1 фосфатазы, фермента осуществляющего дефосфорилирование белков Lhcb1 и Lhcb2. Показано, что пероксид водорода не влияет на активность данного белка, что подтверждает предположение о воздействии пероксида водорода именно на STN7 киназу. Впервые показано, что TAP38/PPH1 фосфатаза обладает разной активностью в отношении Lhcb1-P и Lhcb2-P белков. Дефосфорилирование Lhcb2-P белка происходит более быстро и более эффективно по сравнению с Lhcb1-P белком. При исследовании фотоингибирования фотосистемы 1 показано, что наличие АТФ (субстрат тилакоидных киназ) не влияет на развитие фотоингибирования ФС1; также не выявлено отличий в характере развития фотоингибирования ФС1 в тилакоидах арабидопсиса ДТ, мутанта без STN7 киназы и мутанта без TAP38/PPH1 фосфатазы. Обнаружено, что катализируемое STN7 фосфорилирование способствует сохранению активности ФС1 в суспензии тилакоидов арабидопсиса ДТ при стационарном освещении; при этом вероятно мишенью STN7 киназы являются не белки ССК2, а какие-либо другие из известных или еще неизвестных белков мишеней STN7 киназы. Показано, что в растениях дикого типа возрастание освещенности приводит к снижению содержания АТФ в листьях, что также может быть одной из причин ингибирваония state transitions при возрастании освещенности. Все полученные результаты предполагают комплексное регулирование протекания state transitions в хлоропластах высших растениях, включающее зависимость активности от наличия субстрата STN7 киназы (АТФ) в первые минуты повышения освещенности, редокс регуляцию активности фермента пероксидом водорода в первые минуты/часы повышения освещенности, а также регуляцию количества белка STN7 на уровне регуляции его экспрессии при длительном повышении освещенности (сутки).

Публикации