Молекулярные механизмы протективного иммунитета и антитело-зависимого усиления инфекции при клещевом энцефалите

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10103

НазваниеМолекулярные механизмы протективного иммунитета и антитело-зависимого усиления инфекции при клещевом энцефалите

Руководитель Хлусевич Яна Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова вирус клещевого энцефалита, антитело, гликопротеин Е, неструктурный белок NS1, протективность, антитело-зависимое усиление инфекции, иммунный ответ, эпитоп, фаговый дисплей, гематоэнцефалический барьер, Fc-рецептор, гуморальный иммунитет, ADE

Код ГРНТИ34.15.33

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Предлагаемый проект направлен на изучение вклада неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита в патогенез вирусного клещевого энцефалита и его способности влиять на проницаемость гематоэнцефалического барьера; на изучение молекулярных основ возникновения протективного иммунитета при этом заболевании, а так же на изучение структурных паттернов иммуногенных белков вируса клещевого энцефалита для возникновения или отсутствия антитело-зависимого усиления инфекции (ADE). В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении молекулярных механизмов патогенеза флавивирусных инфекций, переносимых комарами. В частности, была показана важная роль белка NS1 флавивирусов, переносимых комарами, в патогенензе геморрагической лихорадки Денге, лихорадки Зика, лихорадки Западного Нила и японского энцефалита. Было показано, что белок NS1 при флавивирусной инфекции, переносимой комарами, участвует в нарушении проницаемости эндотелия сосудов, эндотелия легких и эндотелия мозга. Кроме того, белок NS1 таких вирусов может ингибировать продукцию интерферонов, подавляя противовирусный иммунитет, может активировать комплемент, чтобы вызвать комплемент-зависимую цитотоксичность в эндотелиальных клетках. К сожалению, такого рода исследования не затрагивали флавивирусы, переносимые клещами, в том числе вирус клещевого энцефалита. На сегодняшний день нет данных о роли NS1 белка вируса клещевого энцефалита в патогенезе вирусного клещевого энцефалита; не получено и не охарактеризовано ни одного протективного антитела против этого белка, хотя известно, что иммунизация мышей белком NS1 ВКЭ приводит к формированию протективного иммунитета, в том числе и гуморального. Также остро стоит вопрос о наличии антитело-зависимого усиления инфекции при клещевом энцефалите, поскольку в России для экстренной профилактики и специфической терапии КЭ используют препарат сывороточного иммуноглобулина, от которого в странах Европы отказались из-за возможности развития ADE при его введении пациентам. Такого рода усиление инфекции при введении специфических антител против белка Е было показано для ряда флавивирусных инфекций, переносимыех комарами, в том числе лихорадки Денге, Японского энцефалита, лихорадки Зика и лихорадки Западного Нила. Без детального изучения возможных механизмов нейтрализации инфекционности вируса КЭ, опосредованных антителами, невозможно определить, какие именно антитела (эпитопная специфичность, аффинность) могут действительно вызывать усиление инфекции. Учитывая наличие разных субтипов вируса клещевого энцефалита, можно ожидать развитие ADE в случае инфекции одним субтипом вируса и введении антител, направленных к другому субтипу (как в случае вируса Денге). В свою очередь, только имея данные о том, какие антитела не приведут к усилению КЭ in vivo ни при каких условиях, можно разрабатывать безопасные препараты для лечения КЭ. В отношении КЭ такие исследования на современном уровне начаты российскими исполнителями предлагаемого проекта. Ранее в нашем институте, при участии членов команды исследователей предлагаемого проекта, были получены панели моноклональных антител против гликопротеина Е и белка NS1 вируса клещевого энцефалита, а также панель химерных антител против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. Эта панель антител послужит основой для выполнения проекта. В ходе выполнения проекта впервые будут получены научные знания о роли неструктурного белка NS1 в патогенезе клещевого энцефалита; его способности влиять на проницаемость клеток эндотелия мозга; о роли антител против этого белка в формировании протективного иммунного ответа. Также впервые будут получены данные о вкладе различных эпитопов белков NS1 и E в особенности формирования гуморального ответа, а также о способности антител против NS1 и гликопротеина Е ВКЭ вызывать антитело-зависимое усиление инфекции. Полученные новые фундаментальные знания о механизмах формирования иммунного ответа при клещевом вирусном энцефалите послужат основой для разработки терапевтических препаратов и вакцин нового поколения, необходимых для решения актуальных задач здравоохранения. Опыт заявителя в выполнении подобных исследований, подтвержденный публикациями в высокорейтинговых журналах и существенный научно-технический задел по теме проекта позволяют рассчитывать на выполнение проекта в полном объеме и получение результатов мирового уровня.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Матвеев А.Л., Хлусевич Я.А., Козлова И.В., Матвеев Л.Э., Емельянова Л.А., Тикунов А.Ю., Байков И.К., Тикуновв Н.В. New Neutralizing Epitope Exposed on the Domain II of Tick-Borne Encephalitis Virus Envelope Glycoprotein E Viruses, 15(6) (год публикации - 2023)
10.3390/v15061256

2. Матвеев А.Л., Емельянова Л.А., Хлусевич Я.А., Козлова И.В., Тикунова Н.В. Антитело FVN-102 нейтрализует вирус клещевого энцефалита IN VIVO, но не IN VITRO Сборник Международной научно-практической конференции «Актуальные природно-очаговые инфекции», С. 40-42 (год публикации - 2023)

3. Кравчук Б.И., Хлусевич Я.А., Матвеев А.Л., Чичерина Г.С., Краснова Е.И., Филимонова Е.С., Тикунова Н.В. Белок NS1 вируса Омской гемморагической лихорадки для дифференциальной диагностики Сборник Международной научно-практической конференции «Актуальные природно-очаговые инфекции», С. 29-33 (год публикации - 2023)

4. Хлусевич Я.А., Матвеев А.Л., Козлова И.В., Емельянова Л.А., Байков И.К., Тикунова Н.В. Новый нейтрализующий эпитоп, расположенный на домене II гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита Сборник Международной научно-практической конференции «Актуальные природно-очаговые инфекции», С. 62-66 (год публикации - 2023)

5. Кравчук Б.И., Хлусевич Я.А., Матвеев А.Л., Чичерина Г.C., Краснова Е.И., Филимонова Е.С., Тикунова Н.В. Получение белка NS1 для дифференциальной диагностики ОГЛ Материалы школы-конференции "XX Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии", с.82 (год публикации - 2023)
10.47471/20_2023_09_04_08_0

6. Хлусевич Я.А., Кравчук Б.И., Чичерина Г.С., Якименко В.Б., Краснова Е.И., Тикунова Н.В., Матвеев А.Л. Omsk hemorrhagic fever virus NS1 protein: development for differential diagnostics Viruses, 10.20944/preprints202405.0626.v1 (год публикации - 2024)
10.20944/preprints202405.0626.v1

7. Голосова Н.Н., Хлусевич Я.А., Кравчук Б.И., Матвеев А.Л., Емельянова Л.А., Тикунова Н.В. Получение рекомбинантного белка NS1 вируса клещевого энцефалита в эукариотической системе экспрессии Материалы "X Юбилейного Всероссийского форума молодых исследователей «ХимБиоSeasons 2024»", - (год публикации - 2024)

8. Хлусевич Я.А., Матвеев А.Л., Козлова И.В., Емельянова Л.А., Байков И.К., Тикунова Н.В. Нейтрализующее моноклональное антитело против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита: свойства и структурные особенности Современные вызовы структурной и синтетической биологии. Материалы всероссийской школы-конференции, С. 55 (год публикации - 2024)

9. Кравчук Б.И., Хлусевич Я.А., Чичерина Г.С., Якименко В.В., Краснова Е.И., Тикунова Н.В., Матвеев А. Л. Cross-Reactive Antibodies to the NS1 Protein of Omsk Hemorrhagic Fever Virus Are Absent in the Sera of Patients with Tick-Borne Encephalitis Viruses , Viruses 2024, 16(7), 1032 (год публикации - 2024)
10.3390/v16071032

10. Кравчук Б. И., Хлусевич Я. А., Кечин А. А., Тикунова Н. В., Матвеев А. Л. Индукция белком NS1 проницаемости микрососудистых эндотелиальных клеток через активацию сигнальных воспалительных путей Сборник тезисов II школы молодых ученых «Современные вызовы молекулярной биологии» (год публикации - 2025)

11. Яковлев Т.М., Матвеев А.Л., Тикунова Н.В., Хлусевич Я.А. Химерные антитела против белка NS1 вируса клещевого энцефалита Сборник тезисов научной молодежной школы-конференции Bio Top-2024. Bio Top-2024 научная молодежная школа-конференция (год публикации - 2024)

12. Хлусевич Я.А., Кравчук Б.И., Кечин А.А., Степанова А.О., Емельянова Л.А., Хачатрян С.М., Емельянова Л.А., Тикунова Н.В., Матвеев А.Л. TBEV NS1 Induces Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Permeability by Activation TNF-α Signaling Pathway International Journal of Molecular Sciences (год публикации - 2025)
https://www.preprints.org/manuscript/202505.0291/v1

13. Кравчук Б.И., Матвеев А.Л., Кечин А.А., Степанова А.О., Емельянова Л.А., Хачатрян С.М., Емельянова Л.А., Тикунова Н.В., Хлусевич Я.А. Orthoflavivirus omskense NS1 Protein Induces Microvascular Endothelial Permeability Viruses (год публикации - 2025)

14. Кравчук Б.И., Хлусевич Я.А., Чичерина Г.С., Тикунова Н.В., Кечин А.А., Матвеев А.Л. Белок NS1 вируса омской геморрагической лихорадки: роль в патогенезе Сборник тезисов ХI Международной конференции молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины Openbio (год публикации - 2024)
DOI 10.25205/978-5-4437-1691-6

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В последние годы произошел прорыв в понимании молекулярных механизмов патогенеза флавивирусных инфекций, переносимых комарами. Так была подтверждена центральная роль белка NS1 флавивирусов, переносимых комарами, в патогенензе геморрагической лихорадки денге, лихорадки Зика, лихорадки западного Нила и японского энцефалита. Было показано, что флавивирусные белки NS1 увеличивают гиперпроницаемость эндотелиальных клеток, полученных из тканей, связанных с вирусным тропизмом каждого флавивирусного заболевания. К сожалению, такого рода исследования не затрагивали флавивирусы, переносимые клещами, в том числе вирусы из группы клещевого энцефалита актуальные для Российской Федерации. На сегодняшний день нет данных о роли NS1 белка вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и омской геморрагической лихорадки (ВОГЛ) в патогенезе этих вирусных заболеваний; не получено и не охарактеризовано ни одно протективное антитело против этого белка, хотя известно, что иммунизация мышей белком NS1 ВКЭ приводит к формированию протективного иммунитета, в том числе и гуморального. Также остро стоит вопрос о наличии АТ-зависимого усиления (ADE) инфекции при клещевом энцефалите, поскольку в России для экстренной профилактики и специфической терапии КЭ используют препарат сывороточного иммуноглобулина, от которого в странах Европы отказались из-за возможности развития ADE при его введении пациентам. Такого рода усиление инфекции при введении специфических АТ против белка Е было показано для ряда флавивирусных инфекций, переносимыех комарами, в том числе лихорадки денге, японского энцефалита, лихорадки Зика и лихорадки Западного Нила. Поэтому актуальным является изучение вклада неструктурного белка NS1 ВКЭ в патогенез вирусного клещевого энцефалита и его способность влиять на проницаемость гематоэнцефалического барьера, а также изучение молекулярных основ возникновения протективного иммунитета при этом заболевании и изучение структурных паттернов иммуногенных белков ВКЭ, критичных для возникновения или отсутствия АТ-зависимого усиления инфекции. Данный проект направлен на изучение вклада неструктурного белка NS1 ВКЭ и ВОГЛ в патогенез этих вирусных инфекций и способности этих белков влиять на проницаемость гематоэнцефалического барьера; на изучение молекулярных основ возникновения протективного иммунитета при клещевом энцефалите, а также на изучение структурных паттернов иммуногенных белков ВКЭ для возникновения или отсутствия АТ-зависимого усиления инфекции. В третий год выполнения были изучены протективные свойства АТ E-FVN-11, E-FVN-31, E-FVN-32 против гликопротеина Е и АТ NS1-2.299, NS1-2.290, NS1-2.44 против неструктурного белка NS1, имеющих, разные константные домены иммуноглобулинов человека IgG1/каппа и IgG2b/каппа в отношении Сибирского, Европейского и Дальневосточного субтипов ВКЭ in vivo. АТ Е-FVN-11 c константными доменами иммуноглобулинов человека IgG1/каппа и IgG2b/каппа наиболее эффективно защищало модельных животных от всех трех субтипов ВКЭ. Статистически значимой разницы в проективных свойствах АТ с разными константными доменами не наблюдалось. Впервые была продемонстрирована возможность моноклонального АТ NS1-2.290 против неструктурного белка NS1 проявлять протективные свойства по отношению к дальневосточному субтипу ВКЭ. Кроме того, показано, что АТ NS1-2.299 и NS1-2.44 против неструктурного белка NS1 хоть и не обладали выраженной протективной активностью, но статистически значимо увеличивали продолжительность жизни зараженных мышей всеми тремя субтипа ВКЭ. Полученные данные, говорят о важной роли АТ против белка NS1 вируса клещевого энцефалита в формировании пожизненного иммунитета у лиц, переболевших острым клещевым вирусным энцефалитом. Кроме того, полученные данные косвенно подтверждают важную роль белка NS1 в патогенезе клещевого вирусного энцефалита. Было показано, что антитела E-FVN-11, E-FVN-31, E-FVN-32 против гликопротеина Е и антитела NS1-2.299, NS1-2.290, NS1-2.44 против неструктурного белка NS1, имеющие разные константные домены иммуноглобулинов человека IgG1/каппа и IgG2b/каппа, не способны вызвать АТ-опосредованное усиление инфекции in vivo при инфицировании Европейским, Сибирским и Дальневосточным субтипами ВКЭ. С помощью фагового дисплея и сайт направленного мутагенеза были локализованы таргетные эпитопы протективных моноклональных АТ Е-FVN-11, E-FVN-32, E-FVN-31 против белка Е ВКЭ, и впервые локализован эпитоп протективного моноклонального антитела NS1-2.290 против белка NS1 ВКЭ. Впервые анализ данных секвенирования РНК клеток эндотелия капилляров легкого после инкубации с белком NS1 ВОГЛ и без него показал, что различия в уровне экспрессии генов, связанных с клеточными стрессовыми реакциями, сосудистой сигнализации и регуляции клеточно-клеточных соединений, которые приводят к наблюдаемым изменениям на морфологическом уровне, а именно нарушению проницаемости эндотелиального монослоя капилляров легкого. Было показано, что при обработке клеток HLMVEC рекомбинантным белком NS1 ВОГЛ увеличивается уровень экспрессии генов PCDH9, TXNIP, SRSF6, BMP4. Анализ обогащения Gene Ontology (GO) дифференциально экспрессированных генов выявил значительные изменения в биологических процессах, связанных с функцией и целостностью сосудов, таких как: «клеточный ответ на ионы кальция», «ответ на ионы металлов», что указывают на нарушение ионного гомеостаза эндотелия, что является известным триггером изменений сосудистой проницаемости. Кроме того, было обнаружено обогащение путей «сборка синапсов» и «нейрососудистая сигнализация», что может указывать на перекрестное взаимодействие эндотелия с нейронными компонентами, что актуально в контексте развития энцефалита при омской геморрагической лихорадки. В совокупности эти изменения подтверждают гипотезу о том, что белок NS1 ВОГЛ вызывает эндотелиальную дисфункцию и тканеспецифическое ремоделирование сосудов, способствуя повышению проницаемости микрососудов. Все запланированные на третий год проекта работы выполнены в полном объеме. Дополнительно впервые проанализированы данные секвенирования транскриптома клеток эндотелия капилляров легкого человека после воздействия на него белка NS1 ВОГЛ, доказавшие, что этот белок вероятно лежит в основе патофизиологических особенностей при омской геморрагической лихорадке.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Полученные данные о роли белка NS1 в патогенезе клещевого энцефалита, должны быть использованы при создания вакцин нового поколения против вируса клещевого энцефалита. Эти вакцины должны обеспечивать формирование иммунного ответа не только против гликопротеина Е, но и против белка NS1, учитывая его значимость в патогенезе клещевого энцефалита. На основе антитела E-FVN-11, для которого показано отсутствие антитело-зависимого усиления инфекции in vitro и in vivo, и которое обладает высоким вируснейтрализующим и протективным потенциалам ко всем трем субтипам клещевого энцефалита, возможно создания безопасного лекарства для терапии клещевого вирусного энцефалита. Впервые сконструированное химерное антитело против белка NS1 вируса клещевого энцефалита, показав наличие протективной активности и четкое отсутствие способности усиливать инфекцию, также может быть использовано в разработке комплексного терапевтического средства для экстренной профилактики и лечения клещевего энцефалита.