Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведена оценка патогенности для штаммов WA, генотип G1P[8] (ATCC-VR-201) и 568, генотип G3P[3] (№ ГКВ - 2288) ротавируса А человека (РВА) на лабораторных нелинейных мышах. Безродные мыши не чувствительны к ротавирусу, не проявляли клинических симптомов, сохраняли динамику набора массы тела сопоставимую с контрольными мышами. Также не было выявлено значимых различий между экспериментальной группой и контрольной по результатам гистологии и анализа РНК, выделенной из органов, проведенного методом ОТ-ПЦР. Разработана и оптимизирована животная инфекционная модель РВА штамма 568 на мышах линии C57BL/6. Отработан интрагастральный способ заражения с использованием ветеринарного зонда с однократным введением до 200 мкл вирусной жидкости. В ходе экспериментов не было зарегистрировано ни одного случая гибели животных. Мыши были однородны по своему состоянию, активны и не проявляли других признаков заболевания, кроме диареи. На 3-й 4-й дни проявились клинические симптомы инфекции в виде диареи, а к 5-му дню уже начинался прирост массы. Для количественного описания клинической симптоматики, общего функционального состояния мышей и патогенеза инфекционного процесса на основе множества литературных данных была разработана собственная шкала определения признаков диареи у мышей. Продемонстрирована возможность оценки концентрации инфекционных частиц методом бляшкообразования на культуре МА-104 из супернатантов гомогенатов тонкого кишечника; а также возможность полуколичественно оценивать вирусную нагрузку в тканях и кале методом ОТ-ПЦР. Несмотря на более яркое проявление клинической картины на 2ой день после инфицирования у более молодых особей до 4х недель жизни, полуколичественное определение вирусной нагрузки более достоверно продемонстрировано для группы 8-недельных животных. В экспериментах было выявлено значимое изменение состояния мышей и их кала на 3-5 день после заражения. Полученные данные представляют собой научный интерес, т.к. они представляют возможность наблюдать и оценивать клиническую картину на взрослых животных, что открывает путь к изучению не только противовирусных, но и вакцинных препаратов. При изучении противовирусной активности препаратов, в свою очередь, появляется более широкое окно времени для проведения исследований – от 4 до 10 недель. Дополнительно методом секвенирования по Сэнгеру было показано что выделенный из кала мышей ротавирус идентичен исходному по основным поверхностным антигенам VP4 и VP7. Полученные результаты описаны в статье Торкунова и др., 2025 «Оценка патогенности и оптимизация инфекционной модели ротавируса А человека штамм 568 для мышей различных генетических линий», статья принята к публикации в журнале «Лабораторные животные для научных исследований». Выявлен неспецифический потенциал противовирусного действия препаратов миРНК-nPLA, вводимых перорально (гастроэнтерально), в отношении РВА штамма 568 в экспериментах in vivo мыши линии C57BL/6. Предварительно проводили оценку острой токсичности препаратов миРНК-nPLA, флуоресцентно меченных Cy5, с введением максимально возможных дозировок препарата на протяжении 4х дней и наблюдением до 7 дней. Препараты в дозировке 100 мкл и 200 мкл вводили перорально по отработанной методике. В эксперимент были отобраны 6 животных обоих полов линии C57BL/6. Для всех животных в эксперименте наблюдалось незначительное изменение динамики набора массы тела, сопоставимое с динамикой контрольной группы. Гистологическое исследование тканей ЖКТ органов, изъятых через сутки и 7 суток, также не выявило патологий и воспалительных процессов. Не наблюдалась клинических проявлений расстройства ЖКТ, изменения поведения животных или повышения температуры. Таким образом была продемонстрирована возможность применения больших дозировок препаратов миРНК-nPLA на лабораторных мышах с пероральным введением зондом. В вирусологический эксперимент было отобрано 22 самца и 22 самки мышей линии C57BL/6. Все животные были распределены на 6 групп: в четыре экспериментальные и одну контрольную группы вошло по 8 особей обоих полов. Оставшиеся 4 особи использовались в качестве наивных животных. Препараты вводились в дозе 100 мкл; концентрация препаратов по полилактиду PLА составляет 5мг/мл, концентрация миРНК в препарате 28,5 мкг/мкл или 1,5 мкМ. Введение препаратов проводили по лечебно-профилактической схеме: за 24 ч до заражения, и на протяжении 3х дней после. Заражение ротавирусом осуществлялось интрагастральным способом (с помощью зонда) в дозе 8,3 lgТЦИД50/мл. Определение клинических проявлений проводилось по разработанной шкале оценки диареи и динамике изменения массы тела. С целью дальнейшего отслеживания динамики изменения массы тела трех из восьми мышей (самки) наблюдали в течение 5 дней. Остальные пять особей (самцы и одна самка) в каждой группе подвергались эвтаназии на 3-ий день после заражения. Во всех группах масса тела изменялась статистически незначительно. Значимые различия по шкале диареи отмечены на третий день между всеми группами и наивными животными. Максимальный эффект снижения клинических проявлений инфекции наблюдался для групп 2 (препарат миРНК, имеющей мишень в консервативном регионе гена NSP4) и 4 (препарат негативной миРНК, не имеющей мишени в геноме РВА). Оценка вирусной нагрузки методом бляшкообразования показала вирусингибирующее действие всех препаратов миРНК-nPLA, включая контрольные с неспецифической миРНК. Это указывает на возможное неспецифическое или иммуностимулирующее действие капсул nPLA. После заражения и введения препаратов гомогенаты тонкого кишечника анализировали методами ИФА и ОТ-ПЦР для оценки вирусной РНК и антигена. Также выделяли РНК из кала с 1 по 5 день. Полученные данные подтверждают неспецифический противовирусный эффект миРНК-nPLA при пероральном введении против РВА штамма 568. В продолжение работ по предыдущему этапу было показано распределение флуоресцентно меченных миРНК-Су5 по цитоплазме клеток Сасо-2 через 24 и 48 часов после трансфекции, методом конфокальной микроскопии с использованием прижизненного pH-чувствительного маркера лизотрэкера. Было показано накопление флуоресцентной метки в тканях ЖКТ, через 4 часа после перорального введения миРНК-Cy5, инкапсулированных в полилактидные капсулы (Achmetova et al., 2024). Дополнительно, было проведено исследование накопительного эффекта при пероральном введении в течение четырех дней препаратов наноразмерных капсул-nPLA. Исследование проводили на 10 нелинейных мышах. Ежедневно мышам вводили препарат флуоресцентно меченных капсул с 1 по 4 день (согласно схеме введения препаратов в вирусологическом эксперименте in vivo). По результатам визуализации органов in vivo и ex vivo выявлено, что препараты флуоресцентно меченных капсул способны накапливаться в течение недели в тканях ЖКТ, и после окончания приема препарата флуоресценция сохраняется в органах и тканях до 10 дней.