Поиск, структурно-функциональная характеристика и биологическая активность пептидных лигандов кислоточувствительных ионных каналов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-75-10021

НазваниеПоиск, структурно-функциональная характеристика и биологическая активность пептидных лигандов кислоточувствительных ионных каналов

Руководитель Осмаков Дмитрий Игоревич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова ASIC – кислото-чувствительные ионные каналы, фармакология канала, лиганд рецепторные взаимодействия, пептиды, анальгезия, воспаление, мутагенез, структурно-функциональный анализ, электрофизиология, животные модели

Код ГРНТИ34.39.49

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Мембранные рецепторы и ионные каналы отвечают за множество физиологических и патологических процессов, происходящих в клетке, и являются одной из основных мишеней для различных фармакологически активных агентов. Кислоточувствительные ионные каналы (Acid-Sensing Ion Channels, или ASIC каналы), относятся к группе одних из наиболее фармакологически значимых мишеней. Было показано, что они играют важную роль в процессах синаптической пластичности, обучения, памяти, ноцицепции и возникновении хронической боли, ишемической гибели нейронов, нейродегенеративных процессах; развитии воспаления и т.д. В то же время ASIC каналы остаются одними из самых малоизученных ионных каналов в организме. Прежде всего, это касается понимания фундаментальных механизмов функционирования каналов: процессы активации и десенситизации, взаимодействие с эндогенными и экзогенными лигандами, комбинированное влияние лигандов на основные фармакологические характеристики каналов и т.п. Также нерешенной задачей остается выявление причин, обуславливающих фармакологические и биофизические различия, наблюдаемые у ортологов человеческих ASIC каналов и ASIC каналов грызунов, что важно и с практической точки зрения для определения фармакологического потенциала активных соединений. Решение этих фундаментальных задач позволит понять процессы, происходящие в нейронах центральной и периферической нервной систем, где ASIC каналы широко экспрессируются. Поскольку ASIC каналы являются важными компонентами ноцицепции, установление механизмов их работы и обнаружение эффективных селективных лигандов – путь к контролю боли, разработке эффективных неопиоидных анальгетиков. Более того, для ASIC1a канала было показано, что он принимает непосредственное участие в гибели нейронов, что позволяет рассматривать его как мишень для создания новых препаратов для терапии нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, новые способы воздействия на ASIC каналы могут открыть путь к созданию инновационных препаратов для лечения различных воспалительных и нейродегенеративных заболеваний, что особенно важно в связи с увеличением срока активной жизни населения России. Среди возможных способов решения этой проблемы – мутагенез канала с целью локализации функциональных детерминант. Однако более физиологически значимое решение имеет использование набора селективных лигандов, которые не вносят изменения в сам канал, но позволяют фиксировать его в том или ином состоянии. Особая роль в решении поставленной задачи принадлежит новым эндогенным и экзогенным пептидным лигандам, способным с высокой аффинностью и эффективностью модулировать работу этих каналов. В данном проекте будет проведено изучение совершенно новых по структуре и/или по фармакологическим свойствам пептидных лигандов ASIC каналов, для чего будет осуществлен целенаправленный поиск новых активных молекул в ядах морских анемон и базах данных биологически активных нейропептидов с их функциональной характеристикой электрофизиологическими методами. Логическим развитием направления станет разработка усовершенствованных протоколов животных моделей для проверки свойств лигандов как анальгетиков, нейропротекторов, противовоспалительных и седативных средств, построение углубленной молекулярной и математической модели, способной описать поведение канала при взаимодействии с несколькими лигандами и ее экспериментальная апробация на экспрессированных каналах, оптимизация нескольких лигандов для повышения их сродства к определенным подтипам каналов. Уникальные по своим фармакологическим свойствам новые пептидные лиганды ASIC каналов позволят провести совершенно новые эксперименты in vitro и in vivo и в перспективе могут послужить базой для разработки лекарственных препаратов различной направленности (обезболивающие, нейропротекторные, противонаркотические средства, антиконвульсанты, антидепрессанты).

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Осмаков Д.И., Тарасова Н.В., Недорубов А.А., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Дьяченко И.А., Андреев Я.А., Козлов С.А. НОЦИСТАТИН И ПРОДУКТЫ ЕГО ПРОТЕОЛИЗА КАК ДВОЙНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ КИСЛОТО-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ 3-ГО ТИПА (ASIC3), ОБЛАДАЮЩИЕ БОЛЕВЫМ И ОБЕЗБОЛИВАЮЩИМ ЭФФЕКТОМ БИОХИМИЯ, том 88, вып. 12, с. 2531 – 2540 (год публикации - 2023)
10.31857/S032097252312014X

2. Осмаков Д.И., Оноприенко Л.В., Калиновский А.П., Кошелев С.Г., Степаненко В.Н., Андреев Ю.А., Козлов С.А. Опиоидный анальгетик как положительный аллостерический модулятор кислоточувствительных ионных каналов International Journal of Molecular Sciences, 25, 3 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25031413

3. Хасанов Т.А., Малеева Е.Е., Кошелев С.Г., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Дьяченко И.А., Козлов С.А., Андреев Ю.А., Осмаков Д.И. Мутагенез пептидного ингибитора канала ASIC3 приводит к связыванию с доменом большой палец ASIC1a, но снижает анальгетическую активность Marine Drugs, 22(9), 382 (год публикации - 2024)
10.3390/md22090382

4. Хасанов Т.А., Минеев К.С., Калиновский А.П., Королькова Ю.В., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Дьяченко И.А., Козлов С.А., Андреев Ю.А., Осмаков Д.И. Sea anemone Cys‐ladder peptide Ms13‐1 induces a pain response as a positive modulator of acid‐sensing ion channel 1a FEBS Journal (год публикации - 2025)
10.1111/febs.70032

5. Осмаков Д.И., Хасанов Т.А., Малеева Е.Е., Павлов В.М., Паликов В.А., Белозерова О.А., Кошелев С.Г., Королькова Ю.В., Дьяченко И.А., Козлов С.А., Андреев Я.А. Two Amino Acid Substitutions Improve the Pharmacological Profile of the Snake Venom Peptide Mambalgin TOXINS, том 17, выпуск 3 (год публикации - 2025)
10.3390/toxins17030101

6. Осмаков Д.И., Дубодел Е.С., Калиновский А.П., Кошелев С.Г., Андреев Я.А., Королькова Ю.В., Козлов С.А. Human acid-sensing ion channel (ASIC) 1a/3 heteromers in a 1:2 ratio expand the functional capabilities of homomeric ASIC3 and are likely to be physiologically relevant National Science Review (год публикации - 2025)
10.1093/nsr/nwaf418

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На третьем этапе выполнение проекта проводилось по шести ключевым направлениям. 1. Функциональная характеристика пептида Ms13-1 и его мутантных форм. Было установлено, что пептид Ms13-1, высокоаффинный позитивный модулятор канала ASIC1a, не оказывает значимого влияния на долговременную потенциацию и парно-импульсную стимуляцию в гиппокампе мышей при концентрациях 30–900 нМ. Были получены и охарактеризованы бактериально экспрессированные мутанты Ms13-1 (K27A, R30A, H32A, K33A, L31A). Электрофизиологическое тестирование показало, что только мутанты R30A и K33A снижали активность на 10%. Также в транскриптоме яда Metridium senile были выявлены два гомологичных пептида: Ms13-2 (H32Y) и Ms13-3 (D34N). Было показано, что совместное введение Ms13-1 и селективного ингибитора ASIC1 мамбалгина снижало болевой эффект, уменьшая число облизывания и поджатия лапы на 70% и 82%, соответственно, что тем самым подтверждало участие ASIC1a в модуляции боли. Работа по выделению, определению структуры и функции Ms13-1 опубликована в журнале The FEBS Journal (https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/febs.70032). 2. Разработка и исследование улучшенного аналога мамбалгина (Mamb-AL). Создан мутантный пептид Mamb-AL (замены M16→A и M25→L), обладающий как улучшенным связыванием с rASIC1a (по результатам моделирования), так и повышенной биотехнологической доступностью (выход 2,75 мг/л). Электрофизиологические тестирования показали, что Mamb-AL ингибирует ASIC1a эффективнее, чем исходный мамбалгин – IC50 при pH 5.5 и при pH 6.7 составляли 62 нМ (против 110 нМ) и 25 нМ (против 86 нМ), соответственно. Также Mamb-AL превосходил мамбалгин при действии на ASIC1a/3 (в 2,5 раза активнее) и ASIC1b (активнее в 5 раз), при этом также не действуя на ASIC3. Как следствие, Mamb-AL проявил более выраженный анальгетический эффект in vivo (снижение боли на 41% в дозе 0,01 мг/кг). Работа опубликована в журнале Toxins (https://www.mdpi.com/2072-6651/17/3/101). 3. Изучение механизма действия пептида p489. Было показано, что p489 потенцирует ток также через ASIC1a, не влияя на ASIC1b и ASIC2a, со значениями EC50 0,14 мМ для rASIC1a и 0,7 мМ для hASIC1a, приводя к замедлению скорости десенситизации в 3 раза. Также p489 (0,1 мМ) усиливал ток на ASIC1a/3 и ASIC2b/3 гетеромерных каналах на 240% и 250%, соответственно. Было показано отсутствие влияния p489 на значения pH зависимость активации и стационарной десенситизации ASIC3 канала, что указывало на аллостерический механизм действия на мишень. При изучении совместного действия с амилоридом была выявлена новая медленная компонента тока. Были предложены предполагаемые сайты связывания – остатки Asp79 и Asp290 в канале ASIC1a. 4. Исследование действия клинического анальгетика – пептида тафалгина (Taf). Показано, что Taf (0.3 мМ) является аллостерическим модулятором ASIC1a (усиление тока на 40%) и ASIC3 (усиление на 115%), но не влияет на ASIC1b и ASIC2a. Значения EC50 для крысиного и человеческого ASIC3 составили 0.086 мМ и 0.33 мМ, соответственно, а также вдвое замедлялась скорость десенситизации. Наблюдался синергизм действия пептида с амилоридом, но не с APETx2. Таким образом, можно сделать вывод, что клинически используемые концентрации Taf (до 9 мМ) могут нежелательно потенцировать ASIC каналы, особенно в комбинации с другими средствами. Работа опубликована в журнале IJMS (https://www.mdpi.com/1422-0067/25/3/1413). 5. Активность пептидов в модельных системах in vivo. а) Сравнение эффектов пептидов Ugr9-1 (селективный ингибитор ASIC3) и A23K (ингибитор ASIC1a и ASIC3) в модели периферической боли. Пептиды Ugr9-1 и A23K были протестированы в тестах уксуснокислотных корчей и CFA-гиперчувствительности в дозах 0,002, 0,02 и 0,2 мг/кг, в результате чего было показано, что Ugr9-1 оказался более эффективным при всех дозах, тогда как A23K действовал слабее и только при дозе 0.02 мг/кг. Данные результаты свидетельствуют о том, что дополнительная активность по отношению к ASIC1a каналу может негативно сказываться на анальгетическом эффекте. б) Эндогенный болевой медиатор – ноцистатин (rNS). Инъекция 6–20 нмоль rNS вызывала выраженное облизывание лапы у мышей (до 3,5 раз сильнее, чем от GMQ), подтверждая его вклад в ASIC-опосредованную боль. в) Оценка анальгезирующего действия Taf и p489. При интраназальном введении p489 (1 мг/кг) вызывал увеличение болевого порога на 39%, при этом Taf в тех же условиях был неэффективен. Также внутрибрюшинное введение p489 в дозах 10-50 мг/кг приводило к удлинению латентности в тесте «горячая пластина» на 80% и увеличению времени отдергивания хвоста в 2,3 раза. г) Проводилась поведенческая оценка Ms13-1 после интратекального введения пептида в количестве 5.5 нмоль. По 50 из 52 параметров значимых отклонений обнаружено не было, однако отмечалась незначительная тревожность (~30%) через 4 ч по критериям "сопротивление взятию в рук" и "повышенная реакция на приближение объекта". 6. Сравнительный анализ ASIC3 каналов человека (h) и крысы (r), а также функциональная оценка гетеромерных ASIC1a/3 каналов на основе конкатемеров. а) С целью определения участков, ответственных за выявленные существенные различия по чувствительности к протон-индуцированной стационарной десенситизации (значения pH50SSD для r и hASIC3 составляют 7,17 и 7,64, соответственно), в канале rASIC3 поочерёдно заменялись участки на соответствующие фрагменты hASIC3. Наиболее выраженное смещение pH50SSD в сторону значений hASIC3 наблюдалось у мутанта H195D (pH50SSD 7,21). Этот результат указывает на ключевую роль области, содержащей остаток His195, расположенной в первой половине полипептидной цепи ASIC3, в регуляции механизма стационарной десенситизации. б) Основываясь на данных о коэкспрессии субъединиц ASIC1 и ASIC3 в сенсорных нейронах человека, была протестирована гипотеза о том, что in vivo преимущественно формируются гетеромерные каналы с участием обеих субъединиц. С этой целью были созданы трижды сшитые конкатемеры с фиксированным порядком чередования двух субъединиц ASIC1a и одной субъединицы ASIC3, соединённые двумя гибкими линкерами. Функциональные исследования показали, что включение одной субъединицы ASIC3 в состав трёхмерного канала (например, в конкатемере 3-1a-1a) не приводит к изменению параметров SSD, но может снижать чувствительность к активации. При этом вариант 1a-3-1a практически полностью сохранял биофизические свойства гомомерного ASIC1a, включая чувствительность к десенситизации. Таким образом, было показано, что одна субъединица ASIC3 в составе тримерного канала не способна передать свойства SSD, характерные для гомомерного hASIC3, а также была подтверждена способность гетеромерных каналов ASIC1a/3 к полноценной экспрессии и функционированию.

Публикации