Разработка портативного комплекса биоаналитических сенсорных систем раннего оповещения о экологически опасных ситуациях

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-13-20021

НазваниеРазработка портативного комплекса биоаналитических сенсорных систем раннего оповещения о экологически опасных ситуациях

Руководитель Арляпов Вячеслав Алексеевич, Доктор технических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тульский государственный университет" , Тульская обл

Конкурс №77 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах; 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые слова биосенсор, проводящие полимеры, биопленки, наноматериалы, углеродные нанотрубки, печатные электроды, вольтамперометрия, биоэлектрокатализ, микроорганизмы, биохимическое потребление кислорода, фенольный индекс, поверхностно-активные вещества.

Код ГРНТИ31.19.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одним из инновационных направлений развития аналитической химии является разработка амперометрических биосенсоров - современных приборов, сочетающих в себе высокую чувствительность и простоту анализа. Они могут быть с успехом использованы для контроля индивидуальных компонентов и интегральных характеристик в экологическом мониторинге, пищевой промышленности, клинической диагностике. Относительно невысокие характеристики разработанных к настоящему времени микробных биосенсоров, предназначенных для экологического мониторинга, являются толчком к продолжению данных исследований в фундаментальном ключе. Таким образом, цель настоящего научного исследования: разработка комплексного научно-методологического подхода к формированию амперометрических микробных биоаналитических сенсорных систем для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода, фенольного индекса и поверхностно-активных веществ и создание на этой базе прототипа портативного комплекса раннего оповещения о экологически опасных ситуациях. Решение проблемы создания универсальных систем экспресс-мониторинга водных сред будет основано на выборе подхода к формированию биологической рецепторной системы биосенсора, подхода к сопряжению ферментных систем биологического материала с электрохимическими процессами на электроде за счет использования электропроводящих гидрогелей и подхода к направленной модификации наноматериалами поверхности электрохимического датчика. Впервые, с использованием комплекса различных электрохимических методов, будет изучен механизм переноса электронов в системах на основе биосовместимых проводящих гидрогелей. Для ряда проводящих систем на основе фенотиазинов и полиароматических соединений в комплексе с углеродными нанотрубками будут определены характеристики скорости переноса электронов в рассматриваемых системах. Это позволит сравнивать эффективность основных составляющих композита в биоэлектрохимических системах на основе целых клеток микроорганизмов и проследить связь электрохимических параметров с аналитическими и метрологическими характеристиками биосенсора, что в дальнейшем позволит создавать электрохимические биосенсоры с направленными свойствами. Впервые будет показана возможность прямого переноса электронов со значительным увеличением скорости реакции при модификации графитовых печатных электродов электроактивными биопленками. Применение такого подхода к формированию сенсорных датчиков биоанализаторов для экологического мониторинга является новым направлением в аналитической химии и биотехнологии. Таким образом, работа внесет вклад в разработку высокоэффективных аналитических систем на основе биосенсоров. Полученные в ходе выполнения проекта фундаментальные результаты будут использованы при разработке анализатора для экспресс–определения биохимического потребления кислорода, фенольного индекса и ПАВ в сточных и поверхностных водах, который по своим характеристикам и функциональным возможностям будет превосходить описанные зарубежные аналоги. Успешная реализация данного проекта позволит разработать подходы к созданию высокоэффективных аналитических устройств на основе миниатюрных печатных электродов. Такие анализаторы позволят повысить технологическую безопасность страны и увеличить уровень импортозамещения в области экологического мониторинга. Использование простого и надежного экспресс-метода контроля содержания загрязняющих органических веществ в воде позволит быстро определять экологически-опасные ситуации и оперативно реагировать на них. Разработанные биоаналитические приборы могут быть использованы на крупных химических и биотехнологических производствах Тульской области. Кроме того, данное аналитическое оборудование может с успехом использоваться службами, осуществляющими экологический надзор: Министерством природных ресурсов и экологии Тульской области, Управлением Роспотребнадзора, службами МЧС по Тульской области и различными лабораториями.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Кузнецова Л. С., Арляпов В. А., Плеханова Ю. В., Тарасов С. Е., Харькова А. С., Саверина Е. А., Решетилов А. Н. Conductive Polymers and Their Nanocomposites: Application Features in Biosensors and Biofuel Cells Polymers, 2023, 15(18), 3783 (год публикации - 2023)
10.3390/polym15183783

2. Медведева А. С., Дьякова Е. И., Кузнецова Л. С., Миронов В. Г., Гуркин Г. К., Рогова Т. В., Харькова А. С., Мельников П. В., Наумова А. А., Бутусов Д. Н., Арляпов В. А. A Two-Mediator System Based on a Nanocomposite of Redox-Active Polymer Poly(thionine) and SWCNT as an Effective Electron Carrier for Eukaryotic Microorganisms in Biosensor Analyzers Polymers, 2023, 15(16), 3335 (год публикации - 2023)
10.3390/polym15163335

3. Герцен М.М., Переломов Л.В., Арляпов В.А., Атрощенко Ю.М., Мешалкин В.П., Чистякова Т.Б., Ревербери А.П. Degradation of Oil and Petroleum Products in Water by Bioorganic Compositions Based on Humic Acids Energies, 2023, 16(14), 5320; (год публикации - 2023)
10.3390/en16145320

4. Лисовский М.Д., Коробова Е.В., Наумова А.О., Седишев И.П., Маркова А.А., Нгуен М.Т., Кузьмин В.А., Ничуговский А.И., Арляпов В.А., Яштулов Н.А., Мельников П.В. Oligohexamethylene Guanidine Derivative as a Means to Prevent Biological Fouling of a Polymer-Based Composite Optical Oxygen Sensor Polymers, 2023, 15(23), 4508; (год публикации - 2023)
10.3390/polym15234508

5. Перчиков Р.Н., Челюканов М.С., Плеханова Ю.В., Тарасов С.Е., Харьков А.С., Бутусов Д.Н., Арляпов В.А., Накамура Х., Решетилов А.Н. Microbial Biofilms: Features of Formation and Potential for Use in Bioelectrochemical Devices Biosensors, Т. 14. – №. 6. – С. 302. (год публикации - 2024)
10.3390/bios14060302

6. Медведева А.С., Гудкова Е.И., Титова А.С., Харькова А.С., Кузнецова Л.С., Перчиков Р.Н., Иванов В.Р., Рябков Е.Д., Тихонова А.А., Фомина Е.Д., Наумова А.О., Мельников П.В., Бутусов Д.Н., Арляпов В.А. Nanostructured copper electrodes - a new step in the development of microbial bioelectrochemical systems Environmental Science Nano, Т. 11. – №. 11. – С. 4562-4576. (год публикации - 2024)
10.1039/D4EN00440J

7. Гуркин Г.К, Ефремов А.М, Корякина И.Г., Перчиков Р.Н., Харькова А.С., Медведева А.С., Фабиано Б., Ревербери А.П., Арляпов В.А. A Polyhydroxybutyrate-Supported Xerogel Biosensor for Rapid BOD Mapping and Integration with Satellite Data for Regional Water Quality Assessment Gels, Gurkin, G.; Efremov, A.; Koryakina, I.; Perchikov, R.; Kharkova, A.; Medvedeva, A.; Fabiano, B.; Reverberi, A.P.; Arlyapov, V. A Polyhydroxybutyrate-Supported Xerogel Biosensor for Rapid BOD Mapping and Integration with Satellite Data for Regional Water Quality Assessment. Gels 2025, 11, 849. https://doi.org/10.3390/gels11110849 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.3390/gels11110849

8. Челюканов М.С., Гуркин Г.К., Перчиков Р.Н., Медведева А.С., Лаврова Т.В., Белоусова Т.С., Титова А.С., Плеханова Ю.В., Тарасов С.Е., Харькова А.С., Арляпов В.А., Манден Ф., Накамура Х., Решетилов А.Н. Whole Cells of Microorganisms—A Powerful Bioanalytical Tool for Measuring Integral Parameters of Pollution: A Review Biosensors, Cheliukanov, M.; Gurkin, G.; Perchikov, R.; Medvedeva, A.; Lavrova, T.; Belousova, T.; Titova, A.; Plekhanova, Y.; Tarasov, S.; Kharkova, A.; et al. Whole Cells of Microorganisms—A Powerful Bioanalytical Tool for Measuring Integral Parameters of Pollution: A Review. Biosensors 2025, 15, 290. https://doi.org/10.3390/bios15050290 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.3390/bios15050290

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения проекта синтезированы проводящие биосовместимые полимеры на основе полианилина, полипиррола, поли(тионина), поли(нейтрального красного) и кремнийорганического редокс-полимера на основе тетраэтоксисилана. Синтез проведен с использованием химической и электрохимической полимеризации, в зависимости от свойств исходного мономера. Для синтезированных различными способами полимеров изучена и подтверждена их химическая структура. С использованием методов ИК-спектроскопии и Рамановской спектроскопии показано соответствие полученных полимеров их предполагаемым химическим структурам. Поли (нейтральный красный) и поли (тионин) обладают сильной электропроводностью и с большим трудом поддаются анализу методом твердотельной ЯМР-спектроскопии. ПАНИ и полипиррол по результатам твердотельной ЯМР-спектроскопии соответствуют своей предполагаемой структуре. С использованием всех полученных проводящих полимеров сформированы гибридные нанокомпозитные материалы на основе ОСУНТ. Исходя из полученных данных о константах скорости переноса электронов и взаимодействия микроорганизмов с проводящими полимерами и комопозитами следует отметить, что при использовании композита «наноматериал-проводящий полимер», гетерогенная константа переноса электронов увеличивается, это связано с тем, что увеличивается площадь электрода и происходит лучшее прикрепление к поверхности электрода. Таким образом по анализу комплекса кинетических констант наиболее перспективным проводящим полимером для создания биопленочных биосенсоров является ПАНИ и его композит. По результатам определения 3D-архитектуры полученных проводящих полимеров, проведенного методом сканирующей электронной микроскопии с элементным анализом показано что поли(титонин) и поли (нейтральный красный) успешно электрополимеризуются на поверхности электродов, четко видна трехмерная структура пленок с пористой морфологией. Полученный полипиррол имеет структуру микроглобул, которые тесно связанные между собой. Измеренные параметры на фотографии ПАНИ подтверждают образование нановолокон. Наиболее чаще встречаются нановолокна с длиной 361-370 нм и диаметром 41-45 нм. Редокс-активный полимер на основе ТЭОС демонстрирует складчатую структуру матрицы, нанокомпозитный материал имеют более волокнистую структуру и пронизан ОУНТ. По результатам изучения рельефа поверхности модифицированных графитовых электродов методом СЭМ показано, что используемый электрод имеет высокоразвитую поверхность, что потенциально может обеспечить большую площадь контакта биопленок микроорганизмов и проводящей матрицы и позволяет добиться высокой чувствительности биосенсоров на основе разработанных электродов. При использовании ОСУНТ и МСУНТ происходит их равномерное распределение по поверхности электрода, что может способствовать значительному облегчению переноса электронов от биопленок микроорганизмов на электрод. На основе анализа гетерогенной константы скорости переноса электронов на электрод видно, что гетерогенная константа выше в системах на основе ОСУНТ, вероятнее всего это связано с тем, что данный наноматериал имеет наиболее разветвленную поверхность и значительно увеличивает эффективную поверхность электрода. Проведена модификация поверхности электродов после нанесения ОСУНТ биопленками на основе выбранных на 1 году микроорганизмов. По полученным результатам можно сделать вывод что все исследуемые микроорганизмы, кроме Pseudomonas veronii ВКМ B-3835, в виде биопленок обладают электроактивностью при выращивании на одностенных углеродных нанотрубках. Важно отметить, что без модификации электродов ОСУНТ электроактивные свойства биопленок практически не наблюдались, что говорит о решающем воздействии на перенос электронов нанотрубок, которые вероятно встраиваться в полисахаридный матрикс биопленок и значительно усиливают электронный транспорт даже при низких концентрациях выделяемых в биопленку финазиновыми производными. Исходя из полученных СЭМ-изображений можно сделать вывод, что микроорганизмы на не модифицированном электроде образуют менее интенсивную биоплёнку, и присутствуют полые участки поверхности, тогда как на модифицированной наноматериалами поверхности плёнки образуются более интенсивные, что свидетельствует о том что пористость материала электрода напрямую влияет на интенсивность биоплёнки на ней. По результатам лазерной сканирующей конфокальной микроскопии наибольшее обрастание отмечено для A. halodurans ВKM Ac-2997 на ОУНТ в сравнении с контролем без нанотрубок, также большая площадь обрастания характерна для образцов D. tsuruhatensis на ОУНТ. Небольшая толщина биоплёнок положительно сказывается для формирования биоэлектрохимических систем, так как при большом слое матрикса затрудняется диффузия субстратов к клеткам микроорганизмов. По результатам исследования влияние условий окружающей среды показано, что максимальные ответы биосенсоров на основе бактериальных биопленок наблюдаются в диапазоне pH 6,6-7,0. Следует отметить, что микроорганизмы в биопленках проявляют большую физиологическую активность в этом диапазоне pH, чем микроорганизмы в суспензии. На уровне pH равном 6,8 обеспечиваются оптимальные условия для функционирования биосенсора, так как этот pH близок к физиологическому и поддерживает жизнеспособность клеток. Клетки Pseudomonas veronii обладают эффективной системой саморегуляции внутриклеточного давления и способны окислять субстраты при 20% солености среды. Соленость сильно влияет на работу микрооганизмов Pseudomonas putida. Для микроорганизмов Delftia tsuruhatensis работоспособность с физиологической активностью >50 достигается до 8% солёности. Для микроорганизмов Pseudarthrobacter scleromae работоспособность с физиологической активностью >50 достигается до 2,5% солёности. Для микроорганизмов Arthrobacter halodurans работоспособность с физиологической активностью >50 достигается до 10% солёности. Основным фактором, который может снизить ответ биосенсора и даже привести к гибели биорецептора, является наличие в сточных водах ионов тяжелых металлов. Из представленных данных видно, что выбранные бактерии в виде биопленок устойчивы к концентрациям тяжелых металлов в районе 10ПДК.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках реализации проекта «Разработка портативного комплекса биоаналитических сенсорных систем раннего оповещения об экологически опасных ситуациях» в отчетном периоде был выполнен комплекс исследований, направленных на создание фундаментальной основы и прототипов новых биоэлектрохимических устройств для экологического мониторинга и биоэнергетики. Работы велись по трем основным направлениям: разработка гибридных проводящих систем, создание на их основе биосенсоров для экспресс-контроля основных загрязнений и формирование микробных топливных элементов (МТЭ) для утилизации отходов. В качестве базовой платформы для биоэлектрохимических систем были выбраны графито-пастовые электроды, модифицированные композитными материалами на основе проводящего полимера – полианилина (ПАНИ) и одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ). Методом химической полимеризации синтезированы нановолокна полианилина (нПАНИ) с развитой поверхностью. Путем их комбинации с ОУНТ в различных массовых соотношениях создана серия композитов. Установлено, что композит с равным соотношением компонентов (50% нПАНИ:50% ОУНТ) обеспечивает оптимальные характеристики между высокой электропроводностью, биосовместимостью и способностью к формированию стабильных электроактивных биопленок. Комплексное исследование с помощью сканирующей электронной и конфокальной лазерной микроскопии подтвердило формирование зрелых трехмерных биопленок. Методами циклической вольтамперометрии и электрохимической импедансной спектроскопии изучены кинетика и механизм переноса электронов в системе «электрод-композит-биоплёнка». С использованием модели Николсона-Шайна рассчитаны константы скорости взаимодействия между микроорганизмами и проводящими материалами, значения которых составили от 50 до 64 дм3/(г·с), что подтвердило высокую эффективность созданной системы. Проведена оптимизация ключевых параметров: установлено, что нанесение нПАНИ на электрод и использование композита в соотношении 50:50 обеспечивают минимальное сопротивление системы (около 3900 Ом) и максимальную чувствительность. На основе оптимизированных систем разработаны прототипы амперометрических биосенсоров для определения ключевых интегральных показателей загрязнения вод. Биосенсор для определения биохимического потребления кислорода (БПК) разработан на основе системы с биопленкой A. halodurans на композите нПАНИ/ОУНТ. Биосенсор обладает широким линейным диапазоном 1–71 мг О2/дм3, временем отклика 5 минут, операционной стабильностью 8% и сохраняет работоспособность в течение 23 дней. Апробация на 7 реальных пробах поверхностных вод Тульской области показала высокую корреляцию (R2 = 0.9995) со стандартным 5-суточным методом определения БПК5. Для биосенсора на фенольный индекс использован штамм Delftia tsuruhatensis BKM B-3752. Чувствительность составила 1940 нА·дм3/мг, и нижний предел обнаружения 0.006 мг/дм3. Устройство определяет широкий спектр фенольных соединений и стабильно работает в течение 14 суток. Биосенсор на поверхностно-активные вещества создан на основе штамма Pseudomonas putida BKM B-973 и композита ОУНТ-ПАНИ создан сенсор с линейным диапазоном 0.692–6.008 мг/дм3 и операционной стабильностью 3.9%. Результаты анализа проб природных вод статистически не отличались от данных, полученных стандартными методами. Оптимизированные материалы и биоплёнки A. halodurans использованы для создания МТЭ, осуществляющих одновременную утилизацию органических отходов и генерацию электроэнергии. Спроектирована и изготовлена на 3D-принтере двухкамерная ячейка с мембраной Nafion 117. Определены основные энергетические характеристики прототипов. Наибольшая эффективность достигнута при обработке кислых отходов спиртового производства: система на композите нПАНИ/ОУНТ генерировала напряжение до 697 мВ при удельной мощности 33 мВт/м2. Параллельно такая система обеспечила снижение показателей БПК5 и ХПК на 40% и 70% соответственно, подтверждая высокую эффективность очистки. Внутреннее сопротивление элемента составило порядка 35 кОм. Осуществлено успешное масштабирование технологии: 10 последовательно соединенных МТЭ общим объемом 24 литра на основе полипропиленовых корпусов и углеродного войлока. Выходное напряжение батареи (2.2–3.9 В) позволило с помощью DC/DC-преобразователя продемонстрировать возможность зарядки смартфона. Проведена оценка, показывающая потенциальную экономическую эффективность технологии при масштабировании для очистных сооружений крупных городов. Таким образом, впервые разработана универсальная платформа для создания портативных биоэлектрохимических устройств на основе синергетического композита полианилин/углеродные нанотрубки и специфичных электроактивных биоплёнок. Научно обоснован и экспериментально подтвержден выбор оптимального состава композита и параметров иммобилизации, обеспечивающих лучшие характеристики для микробных биосенсоров по чувствительности и стабильности. Практическая значимость заключается в создании прототипов устройств для сверхбыстрого (5 минут) контроля БПК, фенольного индекса и ПАВ, а также в работоспособной технологии получения энергии из отходов. Результаты опубликованы в 2 статьях в международных журналах Q1 (Web of Science, Scopus, БС1).

Публикации

Возможность практического использования результатов
Полученные в ходе выполнения проекта результаты могут быть использованы при разработке биосенсорного анализатора для экспресс–определения биохимического потребления кислорода, фенольного индекса и поверхностно-активных веществ в сточных и поверхностных водах, который по своим характеристикам и функциональным возможностям будет превосходить описанные зарубежные аналоги. Важно отметить, что руководитель и коллектив проекта уже имеют большой опыт практической реализации и коммерциализации результатов фундаментальных и прикладных исследований. Так, совместно с одним из ведущих Российских производителей аналитического оборудования ООО «Эконикс–Эксперт» (г. Москва, http://ionomer.ru) изготовлен коммерческий амперометрический биосенсорный анализатор для экспресс-определения БПК. Данная разработка легла в основу серийно выпускаемого прибора «Эксперт-009» (основан на определении потребления кислорода микроорганизмами). Использование такого анализатора позволяет сократить время анализа стандартного параметра качества воды - БПК5 с 5 суток до 20 минут. В рамках настоящего проекта работы по созданию анализаторов БПК, фенолов и ПАВ вышли на новый уровень, за счет разработки дешевых, миниатюрных и высокочувствительных медиаторных электродов с клетками микроорганизмов. Такие анализаторы позволят повысить технологическую безопасность страны (и Тульской области в частности) и увеличить уровень импортозамещения в области экологического мониторинга. В настоящее время в РФ промышленно выпускается только один анализатор БПК («Эксперт-009») и не выпускаются биосенсорные анализаторы фенолов и ПАВ. Практически все используемое аналитическое оборудование ранее импортировалось из стран ЕС, Японии и США.