Комбинированные противогрибковые препараты для отдельных культур и консорциумов как основа экоориентированных решений

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-14-00092

НазваниеКомбинированные противогрибковые препараты для отдельных культур и консорциумов как основа экоориентированных решений

Руководитель Ефременко Елена Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-301 - Охрана окружающей среды

Ключевые слова противогрибковые препараты, фунгициды, ферменты, компьютерное моделирование, консорциумы, кворум, экологическая безопасность

Код ГРНТИ31.27.22

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Цель Проекта - разработка научно-обоснованных подходов к получению и эффективному применению комплексных противогрибковых препаратов экологической ориентированности с широким спектром противомикробного действия. Предполагается, что за счет реализации в совокупности разных механизмов воздействия на популяции микроскопических грибов и их токсичные метаболиты компоненты разрабатываемых комплексных препаратов будут оказывать разнонаправленное влияние на объекты воздействия. Рациональное комбинирование антимикробных агентов (фунгициды, ферменты, антимикробные пептиды, наночастицы металлов и др.), проявляющих разный механизм воздействия на микроскопические грибы, позволит направленно влиять на рост и развитие как индивидуальных грибных культур (дрожжей и мицелиальных грибов), так и микроскопических грибов, входящих в состав микробных консорциумов, содержащих и другие типы микроорганизмов (другие грибы, бактерии, микроводоросли). В состав антигрибковых комплексов также предполагается включение компонентов, способных подавлять кворумные ответы и осуществлять детоксификацию микотоксинов (низкомолекулярных вторичных метаболитов клеток в высококонцентрированных популяциях микроскопических грибов) и/или ингибировать механизмы их биосинтеза. Теоретические и научно-обоснованные подходы к созданию противогрибковых комплексных препаратов, подтвержденные биоинформационными путями, в том числе с применением методов компьютерного молекулярного моделирования, предполагают проверку на лабораторных биобъектах с оценкой экотоксичности полученных вариантов сред до и после применения полученных разработок. Основными научными задачами этого Проекта являются: - научное обоснование выбора состава противогрибковых препаратов комплексного действия на одиночные культуры микроскопических грибов и грибы, находящиеся в состоянии множественного кворума в консорциумах; - получение образцов противогрибковых препаратов комплексного действия и их характеризация; - конструирование искусственных консорциумов, в том числе в иммобилизованном виде, различного микробного состава для анализа противогрибковых препаратов комплексного действия; - исследование биологической активности (по всем основным показателям в зависимости от механизма воздействия компонентов комплексных препаратов) и эффективности действия (определение условий воздействия и доз) полученных образцов противогрибковых препаратов комплексного действия на индивидуальных смешанных культурах (природных и модельных консорциумах); - обобщение полученных данных с целью выявления общих закономерностей в функционировании комбинированных форм противогрибковых препаратов и объектов воздействия. Также ожидается, что разработка и применение комбинированных противогрибковых препаратов будут способствовать: - формированию научных стратегий рационального комбинирования отобранных партнеров для введения в состав эффективно функционирующих противогрибковых препаратов; - повышению эффективности действия применяемых на сегодняшний день препаратов против микроскопических грибов, в том числе входящих в гетерогенные по составу микробные консорциумы; - расширению диапазона чувствительных к действию противогрибковых препаратов культур благодаря комбинированию в составе комплексов антимикробных агентов с разной специфичностью и механизмами действия; - детоксификации сред с микотоксинами и предотвращению развития антибиотикорезистентности за счёт подавления способности микроскопических грибов формировать устойчивые популяции. В условиях накапливающейся информации о нарастающей резистентности микроскопических грибов к существующим противогрибковым препаратам, наличие информации по воздействию отдельных фунгицидов только на индивидуальные культуры, заявленные в Проекте задачи и ожидаемые результаты, будут обладать новизной, научной и практической значимостью, превосходить современный уровень науки, развивающейся в данном направлении.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Степанов Н.А., Асланлы А.Г., Маслова О.В., Лягин И.В. Quorum Sensing as a Trigger That Improves Characteristics of Microbial Biocatalysts Microorganisms, Том-11, Выпуск-6, Номер статьи-1395 (год публикации - 2023)
10.3390/microorganisms11061395

2. Ефременко Е.Н., Асланлы А.Г., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В. Various Biomimetics, Including Peptides as Antifungals Biomimetics, Том-8, Выпуск-7, Номер статьи-513 (год публикации - 2023)
10.3390/biomimetics8070513

3. Лягин И.В., Асланлы А.Г., Домнин М.В., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Ефременко Е.Н., Metal Nanomaterials and Hydrolytic Enzyme-Based Formulations for Improved Antifungal Activity International Journal of Molecular Sciences, Том-24, Выпуск-14, Номер статьи-11359 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241411359

4. Ефременко Е.Н., Маслова О.В., Лягин И.В., Асланлы А.Г., Сенько О.В., Степанов Н.А., Домнин М.В., Гайдамака С.Н., Агаева М.У., Гайдамака А.О. Перспективы включения металлсодержащих соединений и ферментов в состав противогрибковых препаратов Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 25 сентября 2023г, ООО “Экспо-Биохим-Технологии” Москва, выпуск 21, с.110-111 (год публикации - 2023)
10.37747/2312-640X-2023-21-110-111

5. Маслова О.В., Асланлы А.Г., Сенько О.В., Ефременко Е.Н. Исследование воздействия комбинации бацитрацина и пенициллинацилазы в отношении грибов рода Aspergillus Материалы 13-ой Международной научной конференции «Биокатализ. Фундаментальные исследования и применения» (БИОКАТАЛИЗ - 2023), Суздаль, 25-29 июня 2023, ООО «АДМИРАЛ ПРИНТ», Москва, с.245 (год публикации - 2023)

6. Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Асланлы А.Г., Гайдамака С.Н., Агаева М.У., Гайдамака А.О., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Противогрибковые свойства гуминовых веществ Разработка лекарственных средств – традиции и перспектиивы. II Международная научно-практическая конференция (г. Томск, 04-06 октября 2023 г.): сборник материалов; под ред. М.В. Белоусова, СибГМУ, Томск, с.271-273 (год публикации - 2023)

7. Домнин М.В., Асланлы А.Г., Ефременко Е.Н. Исследование взаимодействий антимикробных пептидов низина и даптомицина с His6-OPH Материалы XVI-й Международной студенческой научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии» (год публикации - 2023)

8. Домнин М.В., Асланлы А.Г., Ефременко Е.Н. Комбинации с противогрибковой активностью на основе антимикробных пептидов и ферментов с лактоназной активностью Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2024», секция «Химия». – Издательство «Перо», Москва, с.971 (год публикации - 2024)

9. Домнин М.В., Асланлы А.Г., Ефременко Е.Н. Комплексные антифунгальные препараты на основе бацитрацина и ферментов с лактоназной активностью Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского, с.115 (год публикации - 2024)

10. Домнин М.В., Асланлы А.Г., Ефременко Е.Н. Исследование взаимодействий антимикробных пептидов и ферментов, разрушающих кворумные молекулы грибов 82-я Международная научно-практическая конференция молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» : сборник статей ; 24–26 апреля 2024 г. / под ред. С. В. Поройского – Волгоград : Изд-во ВолгГМУ, том - 1, с.104-105 (год публикации - 2024)

11. Домнин М.В., Асланлы А.Г., Ефременко Е.Н. Исследование взаимодействий антимикробных пептидов низина и даптомицина с His6-OPH Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии: материалы XVI Международной студенческой научной конференции. — ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ, Ульяновск, с.131-134 (год публикации - 2023)

12. Чумаченко И., Сенко О., Маслова О., Бхаттачарья А., Ефременко Е. Interaction of humic substances and exopolysaccharides of microorganisms Book of Abstracts Ninth International Conference of the CIS IHSS on humic innovative technologies Humic substances and green technologies (HIT-2024), с.83 (год публикации - 2024)

13. Асланлы А.Г., Домнин М.В., Степанов Н.А., Сенько О.В., Ефременко Е.Н. Action enhancement of antimicrobial peptides by their combination with enzymes hydrolyzing fungal quorum molecules International Journal of Biological Macromolecules, Том-280, Выпуск-4, Номер статьи-136066 (год публикации - 2024)
10.1016/j.ijbiomac.2024.136066

14. Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Асланлы А.Г., Угарова Н.Н. Luminescent bacteria as bioindicators in screening and selection of enzymes detoxifying various mycotoxins Sensors, Том-24, Выпуск-3, Номер статьи-763 (год публикации - 2024)
10.3390/s24030763

15. Степанов Н.А., Асланлы А.Г., Домнин М.В., Ефременко Е.Н. Ферменты в составе комбинированных антимикробных средств как улучшители их действия Вестник войск РХБ защиты, Том-8, Выпуск-2, Страницы-146-163 (год публикации - 2024)
10.35825/2587-5728-2024-8-2-146-163

16. Сенько О.В., Степанов Н.А., Маслова О.В., Ефременко Е.Н., Антифунгальная защита строительных материалов производными гуминовых кислот в оценке АТФ-метрией Теоретическая и прикладная экология (Theoretical and Applied Ecology), Выпуск-4, Страницы-6-13 (год публикации - 2024)
10.25750/1995-4301-2024-4-056-063

17. Степанов Н.А., Домнин М.В., Лягин И.В., Гайдамака С.Н., Агаева М.У., Гайдамака А.О., Асланлы А.Г., Сенько О.В., Маслова О.В., Ефременко Е.Н. Комбинированные противогрибковые препараты на основе ферментов и антимикробных пептидов БИОТЕХНОЛОГИЯ: ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ: материалы X междунар. науч.-практ. конф. – Ставрополь: Изд-во СтГМУ, с.36-37 (год публикации - 2024)

18. Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Асланлы А.Г., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В. Подходы к разработкам биогибридных ферментсодержащих материалов Сборник тезисов международной научной конференции-школы БИОГИБРИДНЫЕ СИСТЕМЫ В ХИМИИ, БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ Biohybrid systems in chemistry, biotechnology and medicine, Тульский государственный университет, г. Тула, с.10 (год публикации - 2024)

19. Ефременко Е.Н., Асланлы А.Г., Степанов Н.А., Сенько О.В., Домнин М.В., Лягин И.В., Маслова О.В. Ферменты в антимикробных комбинациях против грибов Издательский дом НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА, Москва (год публикации - 2024)

20. Степанов Н., Сенко О., Ефременко Е. The use of humic substances to suppress the vital activity of mycelial fungi as part of a consortium Book of Abstracts Ninth International Conference of the CIS IHSS on humic innovative technologies Humic substances and green technologies (HIT-2024), c.100 (год публикации - 2024)

21. Маслова О.В., Ефременко Е.Н., Асланлы А.Г., Сенько О.В., Степанов Н.А., Лягин И.В. Комбинированные препараты против грибковых инфекций Сборник научных трудов по материалам Международной научной конференции Университетская наука: взгляд в будущее, посвященной 89-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 8-9 февраля 2024 года). — Курск: ЮЗГУ, С. 564–568 (год публикации - 2024)
10.21626/cb.24.futurescience/

22. Ефременко Е.Н., Асланлы А.Г., Домнин М.В., Степанов Н.А., Сенько О.В. Enzymes with lactonase activity against fungal quorum molecules as effective antifungals Biomolecules, Том-14, Выпуск-3, Номер статьи-383 (год публикации - 2024)
10.3390/biom14030383

23. Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Лягин И.В., Домнин М.В., Асланлы А.Г. “Stop, little pot” as the motto of suppressive management of various microbial consortia Microorganisms, Том-12, Выпуск-8, Номер статьи-1650 (год публикации - 2024)
10.3390/microorganisms12081650

24. Асланлы А.Г., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Ефременко Е.Н. Пептиды как основа противогрибковых препаратов для сельского хозяйства Комплексный подход к научно-техническому обеспечению сельского хозяйства : Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной памяти члена корреспондента РАСХН и НАНКР академика МАЭП и РАВН Бочкарева Я.В. – Рязань : РГАТУ, c. 144-147 (год публикации - 2024)

25. Загидуллина А., Гаранькина В., Сарапина А., Степанов Н., Сенько О., Асланлы А., Домнин М., Маслова О., Ефременко Е. Application of humic substances for inhibition of hydrolytic enzymes of filamentous Book of Abstracts Ninth International Conference of the CIS IHSS on humic innovative technologies Humic substances and green technologies (HIT-2024), с.102 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
При выполнении задач 2-ого года этого Проекта было в общей сложности сгенерировано и проанализировано 2060 компьютерных моделей межмолекулярных взаимодействий 18 ферментов (6 гидролаз молекул кворума грибов, 6 ферментов, деградирующих структурные компоненты клеток грибов и 6 ферментов, катализирующих трансформацию микотоксинов, синтезируемых грибами), с различными веществами, проявляющими антимикробные свойства и ингибирующими 6 внеклеточных гидролитических ферментов грибов. Суммарно среди исследованных веществ, проявляющих антимикробные свойства, было 22 ионофора, 36 органических фунгицидов, 25 антиоксидантов и антикворумных веществ, а также и 16 неорганических металлсодержащих наноматериалов. Эти исследования in silico были проведены, чтобы подобрать лучшие варианты стабильных комбинаций ферментов с молекулами перечисленных веществ, чтобы получить эффективно действующие комбинации с антифунгальными свойствами. Для придания стабильности 18 ферментам, указанным выше, имеющим воздействие на грибы и их молекулы, были исследованы молекулярные модели взаимодействия этих ферментов с 20 полимерами. Полученные фермент-содержащие полимерные комплексы в комбинации с антимикробными веществами исследовались на предмет их антифунгального эффекта на клетки 21 микроорганизма, среди которых были преимущественно мицелиальные грибы и дрожжи. Для анализа реакции клеток микроорганизмов на воздействие исследуемых антифунгальных комбинаций использовался метод биолюминесцентной АТФ-метрии. Для ряда компьютерных моделей взаимодействия ферментов с полимерами был задействован суперкомпьютер Ломоносов-2 (МГУ имени М.В. Ломоносова). В процессе компьютерного молекулярного моделирования нековалентных комплексов ферментов с разными полусинтетическими полимерами (полиаминокислотами, полисахаридами и др.) рассчитывались: площадь, занимаемая молекулами полимеров на всей поверхности молекул отдельного ферментов и непосредственно вблизи области расположения их активных центров, степень экранирования входов в активные центры ферментов молекулами исследуемых полимеров, а также энергия связывания (аффинность) молекул разных полимеров с поверхностью молекул ферментов. Отбирались лучшие партнеры между ферментоами и полимерами, которые могли бы образовать стабильные комплексы с каталитическими характеристиками, аналогичными тем, что у нативных ферментов. Часть выбранных полимеров содержала полиаспарагиновую кислоту (ПАК), полиглутаминовую кислоту (ПГК) , полиэтиленгликоль (ПЭГ) с разным количеством мономерных остатков. На основе проделанных анализов in silico были получены фермент-содержащие полимерные комплексы, определены их размеры методом анализа траекторий наночастиц, их каталитические и физико-химические характеристики. Комплексы ферментов, гидролизующих молекулы кворума грибов, с полимерами имели размер 35-45 нм. Размер полимерных комплексов ферментами, которые катализировали деградацию компонентов клеточных стенок грибов, был следующим: у хитиназы ChiC– 75-90 нм, у β-1,4-глюканазы– 65-80 нм. У глюкозооксидазы GOx, действующей против микотоксинов, в комплексе с полимерами размер был 170-176 нм. Анализ каталитических характеристик для полученных полимерных комплексов ферментов показал, что эффективности действия ферментов в составе полученных комплексов схожими с уровнем исходных ферментов или выше их. Термоинактивация ферментов в составе полученных полимерных комплексов показала более высокую стабильность комплексов в сравнении с нативными ферментами, и она сохраняется во всем диапазоне исследованных температур (до 70оС). Каталитически активные полимерные комплексы ферментов были скомбинированы с различными веществами, проявляющими антимикробные свойства, и исследован их антифунгальный эффект на различные клетки мицелиальных грибов и дрожжей. Сравнение полученных результатов с ранее полученными показали улучшение действия комбинаций: в случае клеток Aspergillus niger и Fuzarium solani наибольшую эффективность действия имела комбинация на основе лактоназы AiiA/ПАК50/клотримазол (улучшение в 646 и 600 раз, соответственно); в случае Trichoderma atroviridae - комбинация органофосфатгидролазы His6-OPH/полимиксин В (увеличение в 4523 раз); в случае клеток Rhizopus oryzae - комбинация His6-OPH/полимиксин B (увеличение в 2200 раз); в случае клеток дрожжей S. cerevisiae - комбинация NDM-1/ПАК50/полимиксин B (увеличение в 34 раза); в случае клеток дрожжей Candida tropicalis – пять комбинаций His6-OPH/ПАК50/полимиксин B, AiiA/ПАК50/полимиксин B, NDM-1/ПАК50/полимиксин B, NDM-1/ПГК50/полимиксин B, AiiA/ПГК50/полимиксин B (увеличение в 12,5-13 раз для всех комбинаций). Против тех же мицелиальных грибов и дрожжей было установлено улучшение действия и комплексов ферментов, деградирующих компоненты клеточных стенок грибов, в составе разных комбинаций, лучшими из которых по своему действию были следующие: против клеток Rhizopus oryzae – комбинации хитиназы ChiC с 3 антимикробными агентами и β-1-4-глюканазы в сочетании с полимиксином В, колистином или клотримазолом (увеличение антифунгального эффекта до 250 раз), против клеток дрожжей S. cerevisiae и C. tropicalis - комбинация ChiC/клотримазол (увеличение эффекта в 125 и 800 раз, соответственно). Была проведена оптимизация состава комбинаций и оценен вклад каждого из партнеров в составе полученных антифунгальных комбинаций. Самое сильное действие комбинации пенконазола и комплекса GOx было показано на клетках грибов рода Trichoderma со снижением остаточной концентрации АТФ в клетках в 10000 раз (это 99,99% элиминирование клеток). Это уникальный результат. Был проведен анализ и отбор различных ингибиторов (гуминовые кислоты, ионы металлов, сидерофоры и др.) для ферментов, секретируемых грибами, для применения их в качестве антифунгальных средств в комбинации с вышеописанными ферментами. На основе анализа 1485 компьютерных моделей было отобрано всего 7 веществ. Последующее экспериментальное исследование ингибирования ими ферментов, секретируемых грибами (альфа-амилазы, пектиназы, протеазы, липазы и целлюлазы), позволило отобрать только монензин (Ki = 41-80 μM), который применяется в кормовой промышленности. Впервые была показана высокая эффективность применения гуминовых кислот для ингибирования роста мицелиальных грибов Aspergillus niger и Stachybotrys chartarum в составе строительных материалов (межшовной затирке для облицовочной плитки и обойном клее). Полученные результаты при выполнении задач этого Проекта были опубликованы в 10 статьях, 1 монографии, представлены на международных научных конференциях и в СМИ (https://rscf.ru/news/release/fermenty-nozhnitsy-do-5000-raz-povysili-effektivnost-protivogribkovykh-preparatov/).

Публикации