КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 23-14-00160
НазваниеМикробные родопсины микроорганизмов экстремофилов - структура и динамика
Руководитель Охрименко Иван Станиславович, Кандидат физико-математических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва
Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика
Ключевые слова микробные родопсины, структурная биология, белковая инженерия, экспресcия генов мембранных белков, оптическая спектроскопия, фотоцикл микробных родопсинов кристаллизация мембранных белков, рентгеноструктурные исследования белков, ЯМР спектроскопия белков, молекулярная динамика, биофизика, внутри и межмолекулярные взаимодействия, компьютерное моделирование мембранных белков
Код ГРНТИ34.17.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Детальное описание короткоживущих функциональных состояний биомолекул является одной из самых сложных задач биофизики и биологии. Такие макромолекулы как бактериородопсины претерпевают ряд квантовых и структурных перестроек (фотоцикл) в процессе переноса протона через мембрану клетки. Короткий срок жизни данных перестроек (от наносекунд до секунд) затрудняет их прямое изучение методами структурной биологии, поэтому точный механизм переноса протона через мембрану до сих пор детально не известен и вызывает дискуссии среди специалистов. В настоящем проекте предполагается впервые изучить динамику полноразмерного активного бактериородопсина (БР) H. salinarum и его мутантов в процессе фотоцикла и переноса протона методом светоиндуцируемого дейтерообмена при помощи ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Полученные фундаментальные знания внесут вклад в практическую основу рационального мутагенеза микробных родопсинов, необходимых для нужд медицины, оптогенетики и биотехнологии, так как белковая инженерия микробных родопсинов требует глубокого понимания их структурно-динамической организации. В этой связи планируется также провести структурные и функциональные исследования протеородопсинов связывающих каротиноиды, которые приводят к расширению спектрального диапазона активации ретинальных белков. Поэтому недавнее обнаружение передачи энергии с каротиноида ретиналю в молекуле протеородопсина бактерии найденной в чистых океанских водах важно с биологической и экологической точки зрения. Мы рассчитываем, что комбинация методов структурной биологии и биофизики позволит выяснить крайне востребованные детали поглощения энергии света микробными родопсинами.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Публикации
1.
Ю.А. Загрядская, Н.А. Любайкина, С.Е. Храпов, С.М. Долотова, А.А. Гавриленкова, Л.Е. Петровская, И.С. Охрименко
Characterization of proteorhodopsin of bacteria found in Antarctica
ИПЦ НГУ, X Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, ви- русологов и молекулярных биологов — 2023: Cб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». — Ново- сибирск : ИПЦ НГУ, 2023. — 814 с. (год публикации - 2023)
10.25205/978-5-4437-1526-1-173
2.
Загрядская Ю.А., Цыбров Ф.М., Чижов И.В., Охрименко И.С.
Spectral changes S. paucimobilis rhodopsin in the presence and absence of Zn2+ as a function of pH
Biophysical Reviews, 15, pages 1425–1861 (2023) (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
С помощью разработанной гетерологической экспрессии в бактериальной системе получены миллиграммовые количества 15N-, 15N/13C-, и 15N/13C/2H-меченных форм рекомбинантного бактериородопсина (БР) H. salinarum. Изотопно-меченые образцы БР, соответствующие разным стадиям фотоцикла, были солюбилизированы в супрамолекулярных мембраноподобных системах в виде бицелл различного липидного состава. Для описания конформационной динамики БР накоплены наборы гетероядерных спектров ЯМР, встроенного в мембраноподобные супрамолекулярные частицы в окружении H2O и D2O. Получено отнесение 1H,13С,15N-резонансов для 196 а.а. БР (~84 % амидных HN сигналов в 1Н/15N-ЯМР спектре), что значительно лучше, чем ранее достигнуто зарубежными группами исследователей. Сделан предварительный анализ структурно-динамических свойства основной цепи БР, встроенных в мембраноподобные супрамолекулярные системы. На основе серии последовательно измеренных ЯМР-спектров проведен мониторинг дейтерообмена 15NН амидных протонов основной цепи БР в двух стадиях фотоцикла. Было проведено множественное глобальное выравнивание аминокислотных последовательностей широкого круга родопсинов с помощью специализированных программных средств, а также структурное выравнивание для выбранных родопсинов. С помощью методов биоинформатики были проведены эксперименты с целью определения и уточнения интерфейсов взаимодействия родопсинов и каротиноидов. Моделирование МД в течении 1 мкс показало (1) стабильное короткое расстояние ~ 1,5 нм между зеаксантином и родопсином HbR1 во всем диапазоне времени, (2) окно фенестрации остается стабильным по размеру и форме в течение всего моделирования МД, и (3) две водородные связи участвуют в обеспечении постоянного минимального расстояния, равного 0,25 нм между каротиноидом и ретиналем.
Публикации
1.
Даниил Корнилов, Сергей Бухдрукер, Федор Цыбров, Игорь Чижов, Виталий Голубев, Павел Кузьмичев, Алексей Власов, Владимир Уверский, Валентин Горделий
Production of eukaryotic heliorhodopsins for structural analysis utilizing the LEXSY expression system
International Journal of Biological Macromolecules, Volume 283, Part 1, December 2024, 137324 (год публикации - 2024)
10.1016/j.ijbiomac.2024.137324
2. Охрименко И.С. Новые молекулярные протонные насосы — зеркальные протеородопсины Биохимия человека: материалы всероссийской конференция с международным участием, 17–19 октября 2024 г. / под общей редакцией В.С. Покровского., Биохимия человека: материалы всероссийской конференция с международным участием, 17–19 октября 2024 г. / под общей редакцией В.С. Покровского. — М.: Е-ното, 2024. — 448 с. (год публикации - 2024)
3.
Охрименко И.С., Любайкина Н.А., Загрядская Ю.А.
Thermal stability of the rhodopsin of Antarctic UV resistant bacteria
Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология: Четырнадцатая
международная мультиконференция : Тез. докл. (Россия, Новосибирск, 5–10 авг. 2024 г.) /
Ин-т цитологии и генетики СО РАН; Новосиб. нац. исслед. гос. ун-т. – Новосибирск: ИЦиГ, Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология: Четырнадцатая
международная мультиконференция : Тез. докл. (Россия, Новосибирск, 5–10 авг. 2024 г.) /
Ин-т цитологии и генетики СО РАН; Новосиб. нац. исслед. гос. ун-т. – Новосибирск: ИЦиГ
СО РАН, 2024. – XXXVI с., 2372 с. – ISBN 978-5-91291-067-8 (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-3.1-48
4. И. С. Левашов И. А. Капранов Д. А. Корнилов Кузьмичев П.К. А. В. Мишин В. И. Борщевский Expanding the Genetic Code in Leishmania tarentolae: A Novel Platform for Membrane Protein Expression with Unnatural Amino Acids Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology (год публикации - 2024)
5. Тальдаев А.Х., Федотов Д.А., Охрименко И.С. Long time-scale classical MD simulation of Hymenobacter psoromatis rhodopsin with carotenoid: an initial step for photochemical investigation Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology (год публикации - 2024)
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведён анализ подвижности бактериородопсина (БР) во время работающего фотоцикла методом светоиндуцированного дейтерообммена NH групп белка с мониторингом процесса дейтерообмена по интенсивности сигналов в 1H-15N TROSY спектрах полноразмерного БР. Симуляции молекулярной динамики (МД) на основе данных полученных ранее методами РСА и данных полученных методами ЯМР были проведены в явном липидном бислое. Таким образом, была исследована структурная динамика бактериородопсина, в том числе в фотоцикле.
Оценена эффективность переноса энергии между каротиноидом и ретиналем родопсина gR (Gloeobacteria) с известной структурой комплекса в сравнении с родопсином xR.
Спектроскопические характеристики родопсина Hymenobacter psoromatis) были смоделированы с помощью гибридного квантово-механическое/молекулярно-механического (QM/ММ) моделирования на основе равновесной структуры HbR1, с учётом ближайшего аминокислотного окружения ретинального основания Шиффа (RSB).
Созданы новые плазмидные векторы, подобраны условия культивирования, экспрессии, и проведены первые эксперименты по разработке условий выделения (солюбилизации) и очистки родопсинов организмов-экстремофилов Spirosoma radiotolerans и Truepera radiovictrix. Проведён ряд исследовательских работ по оптимизации условий синтеза родопсина экстремофила Exiguobacterium sibiricum, в том числе в присутствии каротиноида.
Проведена экспериментальная работа по оптимизации скрининга мутаций белков полученных посредством синтеза в бесклеточной системе экспрессии с целью получения изотопномеченных водорастворимых родопсинов пригодных для исследований методами ЯМР.
Осуществлены исследовательские работы по спектроскопической характеризации Зеркальных протеородопсинов, в частности, PspR (родопсин Pseudomonas putida), каротиноид-связывающего родопсина gR (Gloeobacteria) в комплексе с каротиноидом и без него.
Возможность практического использования результатов
Данные исследования внесут вклад в понимание механизмов работы не только термостабильных родопсинов экстремофилов, но и родопсинов уже использующихся в оптогенетике. Стабильные продолжительное время родопсины и сами перспективны в использовании в оптогенетике, тк могут долго осуществлять свою функцию, не требуют постоянного синтеза. Стабильные родопсины перспективны в использовании в перспективных биотехнологических устройствах и сенсорах. Информация о переносе энергии с каротиноида на ретиналь служит для того, чтобы в итоге расширить спектр электромагнитного солнечного излучения принимаемого родопсинами.