Изучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-14-00218

НазваниеИзучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода

Руководитель Дмитриев Сергей Евгеньевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова биосинтез белка, рибосома, трансляционные факторы, терминация трансляции, рибосомный рециклинг, реинициация трансляции, uORF, локализованная трансляция, селеноцистеин, пикорнавирусы, IRES, ITAF, CRISPR/Cas-опосредованный геномный скрининг, низкомолекулярные ингибиторы, рибосомный профайлинг

Код ГРНТИ34.15.25

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Биосинтез белка – один из важнейших метаболических процессов в клетке. Он требует сложного молекулярного аппарата, включающего сотни специализированных компонентов, и круг известных участников этого процесса постоянно расширяется. Одно из направлений нашего проекта будет связано с выявлением новых и малоизученных трансляционных компонентов посредством проведения высокопроизводительных генетических скринингов на основе технологии CRISPR/Cas. Современные методы биохимии, клеточной биологии и молекулярной генетики, которыми владеют члены нашего коллектива, позволят приблизиться к пониманию функций таких компонентов путём нарушения работы их генов и последующего анализа изменений в активности репортерных генов. Для анализа профиля генной экспрессии мутантных клеток могут также применяться методы системной биологии (например, транскриптомика и рибосомный профайлинг). Такой интегрированный подход даст возможность не только изучить конкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе интересующих нас явлений, но и понять их место в общей картине регуляции экспрессии генов в клетке. В частности, в рамках данного направления будут исследованы механизмы реинициации трансляции и регуляции встраивания селеноцистеина, которые пока не были проанализированы системными методами. Ещё сложнее организован процесс белкового синтеза в клетках, заражённых вирусами. Многие вирусы модифицируют компоненты трансляционного аппарата, чтобы заблокировать продукцию клеточных белков, а для трансляции собственных мРНК используют неканонические механизмы. Поиск и изучение клеточных белков, обеспечивающих работу этих механизмов, будет вторым направлением нашей работы. Мы собираемся изучить вклад в вирусную инфекцию конкретных белков, взаимодействующих с IRES-элементами (участками внутреннего связывания рибосом) пикорнавирусных мРНК, - так называемых ITAF (англ. IRES trans-acting factor). Будет изучен механизм работы нового потенциального ITAF, найденного нами недавно с помощью CRISPR-скрининга, а также определена роль некоторых других ITAF, ранее изучавшихся только в искусственных in vitro системах, в живых клетках в контексте вирусной инфекции. Нужно заметить, что для нормального жизненного цикла вируса очень важно интенсивное производство вирусных белков. Поэтому активация внутриклеточных механизмов, ингибирующих трансляцию в клетке, а также её искусственное подавление низкомолекулярными веществами часто приводит к замедлению вирусной инфекции, что даёт организму время для организации антивирусного ответа. В рамках третьего направления на доступной коллекции пикорнавирусов мы протестируем собранную нами панель малоизученных низкомолекулярных ингибиторов белкового синтеза, состоящую из представителей различных классов (ингибиторов рибосомы, трансляционных факторов, аминоацил-тРНК-синтетаз и модуляторов сигнальных каскадов). Изменения в динамике вирусной инфекции будут отслеживаться как простыми цитологическими текстами, так и с помощью специально созданных репортерных систем. Этот анализ поможет получить представления о том, внутри каких классов ингибиторов имеет смысл искать новые низкомолекулярные соединения, способные стать эффективными противовирусными препаратами. Кадровый и методический потенциал, накопленный нашим коллективом в ходе выполнения недавно закончившегося «мегагранта», а также научный задел, сформированный при выполнении предыдущего гранта РНФ, позволяет нам ставить перед собой подобные амбициозные задачи и быть уверенными в возможности их выполнения.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тихонов С.A., Батин М., Гладышев В.Н., Дмитриев С.Е., Тышковский А.Э. AgeMeta: quantitative gene expression database of mammalian aging Биохимия / Biochemistry (Moscow), AgeMeta: количественная база данных изменений экспрессии генов в процессе старения млекопитающих (год публикации - 2024)
0.31857/S0320972524020099

2. Камынина М., Розенберг Ю.М., Кущенко А.С., Дмитриев С.Е., Модестов А., Камашев Д., Гайфуллин Н., Шабан Н., Сунцова М., Емельянова А., Буздин А.А. Forced Overexpression and Knockout Analysis of SLC30A and SLC39A Family Genes Suggests Their Involvement in Establishing Resistance to Cisplatin in Human Cancer Cells International Journal of Molecular Sciences, 25, 22, 12049 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252212049

3. Кущенко А.С., Головко В.А., Панова Е.А., Красота А.Ю., Ивин Ю.Ю., Сухинина А.П., Дмитриев С.Е. Белок PA2G4 млекопитающих необходим для размножения вируса энцефаломиокардита СБОРНИК ТРУДОВ КУРЧАТОВСКОГО ГЕНОМНОГО ФОРУМА 2024 (год публикации - 2024)

4. Дмитриев С.Е. РНК-связывающие белки в жизненном цикле пикорнавирусов: от CRISPR-скрининга к функции VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024 и XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ (год публикации - 2024)

5. Кущенко А.С., Гробушкин П.А., Красота А.Ю., Ивин Ю.Ю., Иванова О.Е., Агол В.И., Дмитриев С.Е. Ген MBNL1 человека участвует в жизненном цикле эховирусов и вирусов Коксаки типа А СБОРНИК ТРУДОВ КУРЧАТОВСКОГО ГЕНОМНОГО ФОРУМА 2024 (год публикации - 2024)

6. Дмитриев С.Е. Омолаживающие эффекты клеточного репрограммирования, выявляемые с помощью транскриптомных часов VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024 и XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ (год публикации - 2024)

7. Панова Е.А., Коноплева М.В., Сорокин И.И., Гущин В.А., Дмитриев С.Е. Влияние замен U на N1mΨ на работу структурно-функциональных элементов в синтетических мРНК, используемых для трансфекции клеток млекопитающих СБОРНИК ТРУДОВ КУРЧАТОВСКОГО ГЕНОМНОГО ФОРУМА 2024 (год публикации - 2024)

8. Дмитриев С.Е. Инструменты для анализа экспрессии экзогенных мРНК в живых системах Сборник тезисов саммита разработчиков лекарственных препаратов Сириус.Биотех2025, стр. 57 (год публикации - 2025)

9. Крюков Д.О., Храмеева Е.Е., Гладышев В.Н., Дмитриев С.Е., Тышковский А.Э. Омолаживающие эффекты клеточного репрограммирования могут быть отделены от потери тканевой идентичности Конференция "Биохимия человека 2024" (год публикации - 2024)

10. Кущенко А.С., Головко В.А., Панова Е.А., Сухинина А.П., Гладнева Е.Е., Красота А.Ю., Ивин Ю.Ю., Потеряхина А.В., Агол В.И., Дмитриев С.Е. The p48 isoform of the PA2G4/EBP1/ITAF45 oncoprotein is required for the encephalomyocarditis virus IRES-driven translation initiation Nucleic Acids Research, 53, 22, gkaf1281. (год публикации - 2025)
10.1093/nar/gkaf1281

11. Колосова О., Згадзай Ю., Стеценко А., Сухинина А.П., Атамас А., Валидов С., Рогачев А., Усачев К., Дженнер Л., Дмитриев С.Е., Юсупова Г., Гуськов А., Юсупов М. Mechanism of read-through enhancement by aminoglycosides and mefloquine Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), 122, 17, e2420261122 (год публикации - 2025)
10.1073/pnas.2420261122

12. Логран Г., Андреев Д.Е., Теренин И.М., Нами О., Микл М., Йорданова М.М., Макманус С.Дж., Ферт А.Э., Аткинс Дж.Ф., Фрейзер К.С., Игнатова З., Ивасаки С., Куфель Дж., Ларссон О., Лейдел С.А., Манкин А.С., Валашек Л.С., Дмитриев С.Е., Баранов П.В. Guidelines for minimal reporting requirements, design and interpretation of experiments involving the use of eukaryotic dual gene expression reporters (MINDR) Nature Structural & Molecular Biology, 32, 3, 418-430 (год публикации - 2025)
10.1038/s41594-025-01492-x

13. Дмитриев С.Е., Луппов Д., Кац Л.М., Анисимова А.С., Теренин И.М. Transcriptome-wide analysis of protein synthesis: Ribosome profiling and beyond Handbook of Translational Transcriptomics, ed. by Buzdin A., Elsevier Academic Press (Amsterdam), Глава в книге "Handbook of Translational Transcriptomics" п/ред. Буздина А., изд. Elsevier Academic Press, 2025, стр. 231-298 (год публикации - 2025)
10.1016/B978-0-443-19110-7.00015-X

14. Кущенко А.С., Головко В.А., Алексеева О.Н., Гробушкин П.А., Ферберг А.С., Панова Е.А., Красота А.Ю., Ивин Ю.Ю., Сухинина А.П., Иванова О.Е., Агол В.И., Липатова А.В., Дмитриев С.Е. Идентификация клеточных РНК-связывающих белков, участвующих в жизненном цикле пикорнавирусов, посредством CRISPR-скрининга Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ. Сборник материалов международной научной конференции, посвященной 120-летию со дня рождения академика А. Н. Белозерского и 90-летию со дня рождения академика В. П. Скулачёва, Москва, 20–22 февраля 2025 г. / под общ. ред. П. В. Сергиева. — Москва : Издательство Московского университета, 2025. — 172 с. — Электронное издание сетевого распространения., стр. 126 (год публикации - 2025)
10.55959/MSU012229-9-2025

15. Круглов И.И., Кущенко А.С., Тучинская К.К., Бавыкин А.С., Поташникова Д.М., Карганова Г.Г., Дмитриев С.Е. Нокаутный CRISPR-скрининг выявил влияние SLC35B2 и SLC39A8 на характер взаимодействия вируса японского энцефалита с клетками человека Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ. Сборник материалов международной научной конференции, посвященной 120-летию со дня рождения академика А. Н. Белозерского и 90-летию со дня рождения академика В. П. Скулачёва, Москва, 20–22 февраля 2025 г. / под общ. ред. П. В. Сергиева. — Москва : Издательство Московского университета, 2025. — 172 с. — Электронное издание сетевого распространения., стр. 123 (год публикации - 2025)
10.55959/MSU012229-9-2025

16. Замятнина К.А., Ураков В.Н. , Волынкина И.А., Столбоушкина Е.А., Кац Л.М., Каменский П.А., Дмитриев С.Е Влияние мутаций в генах факторов рибосомного рециклинга на реинициацию трансляции в дрожжах Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ. Сборник материалов международной научной конференции, посвященной 120-летию со дня рождения академика А. Н. Белозерского и 90-летию со дня рождения академика В. П. Скулачёва, Москва, 20–22 февраля 2025 г. / под общ. ред. П. В. Сергиева. — Москва : Издательство Московского университета, 2025. — 172 с. — Электронное издание сетевого распространения., стр. 110 (год публикации - 2025)
10.55959/MSU012229-9-2025

17. Замятнина К.А., Ураков В.Н. , Волынкина И.А., Столбоушкина Е.А., Кац Л.М., Каменский П.А., Дмитриев С.Е Структурно-функциональный анализ фактора рибосомного рециклинга Tma22p и его активности в реинициации трансляции в пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae Сборник тезисов 5-го Российского микробиологического конгресса, стр. 267 (год публикации - 2025)

18. Замятнина К.А., Ураков В.Н. , Волынкина И.А., Столбоушкина Е.А., Кац Л.М., Каменский П.А., Дмитриев С.Е Влияние аминокислотных замен и делеций на активность дрожжевого фактора рибосомного рециклинга Tma22p/DENR in vivo Сборник тезисов Курчатовского геномного форума (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
За отчётный период с целью изучения молекулярных механизмов инициации, терминации и реинициации трансляции было проведено шесть CRISPR-скринингов на бицистронных конструкциях, кодирующих флуоресцентные белки, в том числе на стабильных линиях и (впервые) путём мРНК-трансфекции. Получены предварительные списки «хитов», выявлены гены – кандидаты для дальнейшего изучения. Разработана система для проведения CRISPR-скрининга, направленного на поиск генов, продукты которых вовлечены в молекулярные механизмы поглощения РНК при мРНК-трансфекции клеток, основанная на новом маркёре негативной селекции. Вместе с большим международным коллективом авторов разработаны «Минимальные требования к использованию бицистронных репортеров». На панели репортерных конструкций с IRES-элементами четырёх классических типов систематически проанализировано влияние тотальной замены уридина на m1-псевдоуридин (применяемой в современных мРНК-вакцинах) на активность IRES-элементов, сделан вывод о практически полной инактивации большинства IRES-элементов. Показано, что нокаут гена PA2G4 делает клетки НЕК293Т устойчивыми к заражению вирусом энцефаломиокардита (EMCV), а также очень сильно снижает эффективность трансляции, направляемой IRES-элементом EMCV. Наработаны в E.coli и выделены рекомбинантные белки архей, предположительно являющиеся факторами рибосомного рециклинга. В сотрудничестве с лабораторией А.Буздина (Сеченовский Университет) получены несколько нокаутных линий по генам SLC39A8 и SLC39A14 (на основе линий аденокрцином HCT-15 и HuTu80) и показано, что отсутствие генов изменяет устойчивость опухолевых клеток к некоторым химиотерапевтическим препаратам, что позволяет говорить о потенциале белков семейства SLC39A как мишеней для разработки новых противоопухолевых терапий. В сотрудничестве с лабораторией В.Гладышева (Гарвардская школа медицины) разработаны надёжные мультитканевые транскриптомные часы биологического возраста (tAge) для млекопитающих. Часы применены для анализа изменений биологического возраста клеток в процессах клеточного репрограммирования и эмбриогенеза.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году получены моноклональные линии с нокаутами генов STRAP и CSDE1, изучено влияние этих нокаутов на активность вирусных IRES-элементов разных типов, различающихся структурой и механизмами функционирования, с помощью двух типов бицистронных репортерных конструкций: флуоресцентных и люциферазных. Показано сильное снижение активности IRES-элементов риновируса HRV и полиовируса PV (тип I IRES-элементов) в нокаутных клетках и отсутствие эффекта нокаутов в случае IRES-элементов вирусов энцефаломиокардита EMCV и вируса гепатита С, HCV (типы II и III IRES-элементов). Получены также линии с одиночными и двойными нокаутами гена SLC35B2, кодирующего транспортер 3′ фосфоаденозин-5′-фосфосульфата, и гена SLC39A8/ZIP8, кодирующего транспортер ионов металлов. Продукты генов ответственны за синтез и присоединение остатков гепарансульфатов к поверхностным белкам клетки и важны для проникновения вируса японского энцефалита в клетку. Показана их повышенная устойчивость к заражению вирусом. Продолжена и завершена работа по изучению роли белка ITAF45/PA2G4 в жизненном цикле вируса энцефаломиокардита (EMCV). На основе полученных ранее нокаутных клеток путём лентивирусной трансдукции получены стабильные линии, экспрессирующие кДНК двух главных изоформ ITAF45/PA2G4: р42 и р48, и выяснено, что экспрессия изоформы р48 полностью «спасает» нокаутный фенотип: на такие клетки вирус оказывает цитопатическое действие, а титр вируса и концентрация геномной РНК растут примерно как в клетках «дикого типа», в то время как изоформа р42 неактивна. Изготовлены бесклеточные системы трансляции на основе клеток PA2G4 КО и клеток «дикого типа», наработаны в E. coli и выделены в очищенном виде изоформы р42 и р48; проанализировано их влияние на активность IRES-элементов EMCV/Mengo и FMDV в бесклеточных системах: выяснено, что изоформа р42 неактивна, в то время как р48 возвращает лизату способность эффективно направлять IRES-зависимую трансляцию. Результаты опубликованы в журнале Nucleic Acids Res. Вместе с группой коллег-единомышленников собраны и систематически проанализированы артефакты метода двойных репортеров при использовании бицистронных конструкций (активно используемых в данном проекте при анализе активности IRES-элементов и сквозного прочтения стоп-кодонов), объяснены их причины, разработаны стандарты, которые позволят «очистить» эту область от ложноположительных результатов, предложены необходимые контроли и минимальные требования при работе с двойными репортерными системами (MINDR). Эти стандарты и рекомендации опубликованы в аналитическом обзоре в журнале Nat Struct Mol Biol. Опыт использования мРНК-трансфекции при изучении механизмов биосинтеза белка, позволяющий избежать широко распространённых артефактов, связанных с аберрантной промоторной активностью и криптическими сайтами сплайсинга в последовательностях репортёров, изложен в докладе на саммите разработчиков препаратов «Сириус.Биотех2025», где руководитель проекта организовал и провёл одну из секций, посвящённых препаратам на основе мРНК. Проверено предположение, что архейный белок, гипотетически представляющий собой aMCTS1, и фактор инициации aIF1, предположительно способный у некоторых архей выполнять роль DENR, могут взаимодействовать друг с другом. 4 гипотетических aMCTS1 из 4 видов архей и 4 aIF1 из этих же видов (2 из которых имели четыре Cys в N-концевой части, как у эукариотического DENR, а два не имели) в рекомбинантном тегированном виде наработаны в E. coli. Попарное объединение лизатов и попытка выделить из такой смеси гетеродимеры по методике, позволившей (в параллельно проведённом опыте) выделить рекомбинантный человеческий гетеродимер MCTS1/DENR, не привела к получению сформированного гетеродимера ни в одном из случаев архейных белков. Негативный результат компенсирован успехами в комплементарной тематике – изучении соответствующих факторов из дрожжей S. cerevisiae (гетеродимера Tma20p/Tma22p, ортолога MCTS1/DENR): с помощью репортерных конструкций измерена частота реинициации трансляции после короткой uORF или после длинной рамки, кодирующей полноценный белок, в клетках дрожжей, а также проведено сравнение штамма дикого типа с нокаутными клетками tma64Δtma22Δ, содержащими введенный ген, кодирующий Tma22p с делециями или аминокислотными заменами в SUI1-домене. Проанализировано влияние нокаутов генов TMA20, TMA22 и TMA64 (индивидуальные, двойные, тройные) на реинициацию. Полученные результаты показали важность консервативной положительно заряженной β-петли в SUI1-домене Tma22p, участвующей в распознавании кодон-антикодонового дуплекса, и больший вклад гетеродимера Tma20p*Tma22p, чем фактора Tma64p, в контроль реинициации трансляции после прочтения uORF. Изучено влияние нескольких низкомолекулярных ингибиторов биосинтеза белка разного типа на протекание вирусной инфекции в культивируемых клетках. Результаты заражения клеток вирусом EMCV, выбранным в качестве модельного, в норме и в присутствии ингибиторов в широком спектре концентраций (в том числе почти не влияющих на жизнеспособность клеток) подтверждают гипотезу, что многие ингибиторы биосинтеза белка препятствуют размножению вируса. Однако сопоставление результатов влияния на жизнеспособность, полученных с помощью разных методов, выявило сложный паттерн, который требует дальнейшего изучения. Показано, что вещество мефлохин усиливает активность аминогликозидов по индукции сквозного прочтения преждевременных стоп-кодонов в репортерных конструкциях, и в сотрудничестве со структурными биологами предложен молекулярный механизм этого явления. Работа опубликована в журнале PNAS, научно-популярное описание открытия выложено в телеграм-канале РНФ: https://t.me/RSF_news/2414.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Хотя данное исследование носит в основном фундаментальный характер, изучение молекулярных механизмов биосинтеза белка и вирусных инфекций, а также низкомолекулярных ингибиторов трансляции потенциально может способствовать разработке противовирусных и противоопухолевых препаратов. Понимание нюансов функционирования трансляционного аппарата необходимо также для разработки лекарств на основе мРНК (что подтверждается участием коллектива в нескольких таких проектах).