Изучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-14-00218

НазваниеИзучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода

Руководитель Дмитриев Сергей Евгеньевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова биосинтез белка, рибосома, трансляционные факторы, терминация трансляции, рибосомный рециклинг, реинициация трансляции, uORF, локализованная трансляция, селеноцистеин, пикорнавирусы, IRES, ITAF, CRISPR/Cas-опосредованный геномный скрининг, низкомолекулярные ингибиторы, рибосомный профайлинг

Код ГРНТИ34.15.25

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Биосинтез белка – один из важнейших метаболических процессов в клетке. Он требует сложного молекулярного аппарата, включающего сотни специализированных компонентов, и круг известных участников этого процесса постоянно расширяется. Одно из направлений нашего проекта будет связано с выявлением новых и малоизученных трансляционных компонентов посредством проведения высокопроизводительных генетических скринингов на основе технологии CRISPR/Cas. Современные методы биохимии, клеточной биологии и молекулярной генетики, которыми владеют члены нашего коллектива, позволят приблизиться к пониманию функций таких компонентов путём нарушения работы их генов и последующего анализа изменений в активности репортерных генов. Для анализа профиля генной экспрессии мутантных клеток могут также применяться методы системной биологии (например, транскриптомика и рибосомный профайлинг). Такой интегрированный подход даст возможность не только изучить конкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе интересующих нас явлений, но и понять их место в общей картине регуляции экспрессии генов в клетке. В частности, в рамках данного направления будут исследованы механизмы реинициации трансляции и регуляции встраивания селеноцистеина, которые пока не были проанализированы системными методами. Ещё сложнее организован процесс белкового синтеза в клетках, заражённых вирусами. Многие вирусы модифицируют компоненты трансляционного аппарата, чтобы заблокировать продукцию клеточных белков, а для трансляции собственных мРНК используют неканонические механизмы. Поиск и изучение клеточных белков, обеспечивающих работу этих механизмов, будет вторым направлением нашей работы. Мы собираемся изучить вклад в вирусную инфекцию конкретных белков, взаимодействующих с IRES-элементами (участками внутреннего связывания рибосом) пикорнавирусных мРНК, - так называемых ITAF (англ. IRES trans-acting factor). Будет изучен механизм работы нового потенциального ITAF, найденного нами недавно с помощью CRISPR-скрининга, а также определена роль некоторых других ITAF, ранее изучавшихся только в искусственных in vitro системах, в живых клетках в контексте вирусной инфекции. Нужно заметить, что для нормального жизненного цикла вируса очень важно интенсивное производство вирусных белков. Поэтому активация внутриклеточных механизмов, ингибирующих трансляцию в клетке, а также её искусственное подавление низкомолекулярными веществами часто приводит к замедлению вирусной инфекции, что даёт организму время для организации антивирусного ответа. В рамках третьего направления на доступной коллекции пикорнавирусов мы протестируем собранную нами панель малоизученных низкомолекулярных ингибиторов белкового синтеза, состоящую из представителей различных классов (ингибиторов рибосомы, трансляционных факторов, аминоацил-тРНК-синтетаз и модуляторов сигнальных каскадов). Изменения в динамике вирусной инфекции будут отслеживаться как простыми цитологическими текстами, так и с помощью специально созданных репортерных систем. Этот анализ поможет получить представления о том, внутри каких классов ингибиторов имеет смысл искать новые низкомолекулярные соединения, способные стать эффективными противовирусными препаратами. Кадровый и методический потенциал, накопленный нашим коллективом в ходе выполнения недавно закончившегося «мегагранта», а также научный задел, сформированный при выполнении предыдущего гранта РНФ, позволяет нам ставить перед собой подобные амбициозные задачи и быть уверенными в возможности их выполнения.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тихонов С.A., Батин М., Гладышев В.Н., Дмитриев С.Е., Тышковский А.Э. AgeMeta: quantitative gene expression database of mammalian aging Биохимия / Biochemistry (Moscow), AgeMeta: количественная база данных изменений экспрессии генов в процессе старения млекопитающих (год публикации - 2024)
0.31857/S0320972524020099

2. Камынина М., Розенберг Ю.М., Кущенко А.С., Дмитриев С.Е., Модестов А., Камашев Д., Гайфуллин Н., Шабан Н., Сунцова М., Емельянова А., Буздин А.А. Forced Overexpression and Knockout Analysis of SLC30A and SLC39A Family Genes Suggests Their Involvement in Establishing Resistance to Cisplatin in Human Cancer Cells International Journal of Molecular Sciences, 25, 22, 12049 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252212049

3. Кущенко А.С., Головко В.А., Панова Е.А., Красота А.Ю., Ивин Ю.Ю., Сухинина А.П., Дмитриев С.Е. Белок PA2G4 млекопитающих необходим для размножения вируса энцефаломиокардита СБОРНИК ТРУДОВ КУРЧАТОВСКОГО ГЕНОМНОГО ФОРУМА 2024 (год публикации - 2024)

4. Дмитриев С.Е. РНК-связывающие белки в жизненном цикле пикорнавирусов: от CRISPR-скрининга к функции VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024 и XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ (год публикации - 2024)

5. Кущенко А.С., Гробушкин П.А., Красота А.Ю., Ивин Ю.Ю., Иванова О.Е., Агол В.И., Дмитриев С.Е. Ген MBNL1 человека участвует в жизненном цикле эховирусов и вирусов Коксаки типа А СБОРНИК ТРУДОВ КУРЧАТОВСКОГО ГЕНОМНОГО ФОРУМА 2024 (год публикации - 2024)

6. Дмитриев С.Е. Омолаживающие эффекты клеточного репрограммирования, выявляемые с помощью транскриптомных часов VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024 и XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ (год публикации - 2024)

7. Панова Е.А., Коноплева М.В., Сорокин И.И., Гущин В.А., Дмитриев С.Е. Влияние замен U на N1mΨ на работу структурно-функциональных элементов в синтетических мРНК, используемых для трансфекции клеток млекопитающих СБОРНИК ТРУДОВ КУРЧАТОВСКОГО ГЕНОМНОГО ФОРУМА 2024 (год публикации - 2024)

8. Крюков Д.О., Храмеева Е.Е., Гладышев В.Н., Дмитриев С.Е., Тышковский А.Э. Омолаживающие эффекты клеточного репрограммирования могут быть отделены от потери тканевой идентичности Конференция "Биохимия человека 2024" (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
За отчётный период с целью изучения молекулярных механизмов инициации, терминации и реинициации трансляции было проведено шесть CRISPR-скринингов на бицистронных конструкциях, кодирующих флуоресцентные белки, в том числе на стабильных линиях и (впервые) путём мРНК-трансфекции. Получены предварительные списки «хитов», выявлены гены – кандидаты для дальнейшего изучения. Разработана система для проведения CRISPR-скрининга, направленного на поиск генов, продукты которых вовлечены в молекулярные механизмы поглощения РНК при мРНК-трансфекции клеток, основанная на новом маркёре негативной селекции. Вместе с большим международным коллективом авторов разработаны «Минимальные требования к использованию бицистронных репортеров». На панели репортерных конструкций с IRES-элементами четырёх классических типов систематически проанализировано влияние тотальной замены уридина на m1-псевдоуридин (применяемой в современных мРНК-вакцинах) на активность IRES-элементов, сделан вывод о практически полной инактивации большинства IRES-элементов. Показано, что нокаут гена PA2G4 делает клетки НЕК293Т устойчивыми к заражению вирусом энцефаломиокардита (EMCV), а также очень сильно снижает эффективность трансляции, направляемой IRES-элементом EMCV. Наработаны в E.coli и выделены рекомбинантные белки архей, предположительно являющиеся факторами рибосомного рециклинга. В сотрудничестве с лабораторией А.Буздина (Сеченовский Университет) получены несколько нокаутных линий по генам SLC39A8 и SLC39A14 (на основе линий аденокрцином HCT-15 и HuTu80) и показано, что отсутствие генов изменяет устойчивость опухолевых клеток к некоторым химиотерапевтическим препаратам, что позволяет говорить о потенциале белков семейства SLC39A как мишеней для разработки новых противоопухолевых терапий. В сотрудничестве с лабораторией В.Гладышева (Гарвардская школа медицины) разработаны надёжные мультитканевые транскриптомные часы биологического возраста (tAge) для млекопитающих. Часы применены для анализа изменений биологического возраста клеток в процессах клеточного репрограммирования и эмбриогенеза.

Публикации