Особенности иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных рукокрылых как основа прогнозирования новых инфекций

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-14-00316

НазваниеОсобенности иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных рукокрылых как основа прогнозирования новых инфекций

Руководитель Ермаков Алексей Михайлович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Донской государственный технический университет" , Ростовская обл

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова летучие мыши, иммунобиология, секвенирование, антибиотикорезистентность, ветеринария, эпизоотология, инфекции, эмерджентные болезни, 3D-биопечать

Код ГРНТИ34.27.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Всемирная организация по охране здоровья животных (Международное эпизоотическое бюро) считает, что дикие животные являются самым важным и при этом самым неизученным звеном в возникновении новых (эмерджентных) инфекций, являясь одной из самых главных проблем современной ветеринарии (https://rr-asia.oie.int/en/projects/wildlife-health/). Летучие мыши, первичный резервуар множества возникающих инфекций человека и продуктивных животных, являются причиной многомиллиардных убытков (32,6 миллиарда долларов в 2015г. по данным Всемирного банка) для сельского хозяйства и здравоохранения. Благодаря способности к полёту и длительному сроку жизни (относительно других млекопитающих того же размера) летучие мыши способны распространять вирусы и бактерии на большие расстояния в длительном временном измерении. Механизмы, которые делают этих животных "живыми биореакторами" новых инфекционных агентов, до конца не изучены. Во время полёта в организме летучих мышей образуется много свободных радикалов, которые нарушают работу вирусных полимераз, что в свою очередь способствует возникновению мутаций у вирусов летучих мышей. Помимо особенностей энергетического обмена в возникновении новых вирусов у летучих мышей задействован их уникальный иммунный ответ, обуславливающий сниженную воспалительную реакцию и длительное бессимптомное вирусоносительство. Ранее нами были определены промутагенные свойства кишечных кисломолочных бактерий летучих мышей, что указывает на потенциальную вовлечённость микробиоты этих животных в возникновении мутаций их вирусов и появлении вариантов, способных преодолеть межвидовой барьер (Popov et al., SciRep, 2021). Планируемое исследование направлено на поиск особенностей иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных летучих мышей, которые составляют основу возникновния новых инфекций. В проект будет включено цитометрическое иммунофенотипирование популяций и субпопуляций клеток иммунной системы при помощи кросс-реактивных антител и валидация полученных данных относительно транскрипционной экспрессии клеточных маркеров; определение уровня продукции антител при помощи иммунофлюоресцентного анализа; аннотация генов-регуляторов иммунной системы у синантропных рукокрылых; определение уровня экспрессии этих генов; метагеномный анализ состава кишечной бактериальной и вирусной микробиоты; филогенетический анализ обнаруженных микроорганизмов; определение генотоксичности и свойств биоплёнок кишечных бактерий. Все эти свойства будут изучены в динамике жизненного цикла рукокрылых, включающего гибернацию, поскольку влияние понижения температуры тела этих животных безусловно должно оказывать воздействие на свойства их иммунной системы и кишечной микробиоты. В настоящий момент отсутствуют конкретные данные о взаимосвязи динамических изменений статуса иммунной системы и кишечной микробиоты до, во время и после гибернации летучих мышей, поэтому заявляемый проект представляет большую научную значимость для глобальной науки. По результатам проекта будут получены данные о взаимосвязи статуса иммунной системы синантропных рукокрылых и состава и свойств кишечной микробиоты, что обеспечит биологическую безопасность единого здоровья животных и человека, поскольку позволит разработать меры профилактики и контроля возникающих инфекций и снизить прямой и косвенный экономический ущерб от них.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Попов И.В., Березинская И.С., Попов И.В., Мартюшева И.Б., Ткачева Е.В., Горобец В.Е., Тихменева Ю.А., Алешукина А.В., Твердохлебова Т.И., Чикиндас М.Л., Венема К., Ермаков А.М. Cultivable Gut Microbiota in Synanthropic Bats: Shifts of Its Composition and Diversity Associated with Hibernation Animals, - №. 23. -Т. 13. -С. 3658. (год публикации - 2023)
10.3390/ani13233658

2. Попов И.В., Попов И.В., Крикунова А.А., Липилкина Т.А., Дерезина Т.Н., Чикиндас М.Л., Венема К., Ермаков А.М. Gut microbiota composition of insectivorous synanthropic and fructivorous zoo bats: a direct metagenomic comparison International Journal of Molecular Sciences, - №. 23. -Т. 24. -С. 17301. (год публикации - 2023)
10.3390/ijms242417301

3. Попов И. В., Пешкова Д. А., Лукбанова Е. А., Цуркова И. С., Емельянцев С. А., Крикунова А. А., Малиновкин А. В., Чикиндас М. Л., Ермаков А. М., Попов И. В. Gut Microbiota Dynamics in Hibernating and Active Nyctalus noctula: Hibernation-Associated Loss of Diversity and Anaerobe Enrichment Veterinary Sciences, - №. 6 -T. 12 -С. 559. (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.3390/vetsci12060559

4. Попов И.В., Чикиндас М.Л., Венема К., Ермаков А.М., Попов И.В. KEGGaNOG: A Lightweight Tool for KEGG Module Profiling From Orthology‐Based Annotations Molecular Nutrition & Food Research, e70269 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.1002/mnfr.70269

5. Попов И.В., Донник И.М., Липилкина Т.А., Березинская И.С., Ткачева Е.В., Лукбанова Е.А., Алешукина А.В., Тихменева Ю.А., Дерезина Т.Н., Евсюков А.П., Твердохлебова Т.И., Ермаков А.М. Composition of the Common Noctule (Nyctalus noctula) Gut Microbiota Determined by Bacteriological Analysis and High-Throughput 16S rRNA Gene Sequencing Microbiology, - №. 6 -T. 93 -С. 916–920. (год публикации - 2024)
10.1134/S0026261724606602

6. Попов И. В., Попов И. В., Чеботарёва Ю. П., Тихменёва Ю. А., Пешкова Д. А., Крикунова А. А., Ткачева Е. В., Альгбури А. Р., Абдулхамид А. М., Жаргалсайхан А., Ганболд О., Чикиндас М. Л., Венема К., Ермаков А. М. Differences in gut microbiota composition, diversity, and predicted functional activity between wild and captive zoo Carollia perspicillata in a One Health perspective Brazilian Journal of Microbiology, - №. 2 -T. 56 -С. 1291–1302. (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.1007/s42770-025-01630-z

7. Попов И. В., Манахов А. Д., Горобец В. Е., Дьякова К. Б., Лукбанова Е. А., Малиновкин А. В., Венема К., Ермаков А. М., Попов И. В. Metagenomic Investigation of Intestinal Microbiota of Insectivorous Synanthropic Bats: Densoviruses, Antibiotic Resistance Genes, and Functional Profiling of Gut Microbial Communities International Journal of Molecular Sciences, - №. 13 -T. 26 -С. 5941. (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.3390/ijms26135941

8. Липилкина Т. А., Алвеш М. В., Карнейру К. О., Леани К., Попов И. В., Попов И. В., Чикиндас М. Л., Ермаков А. М., Тодоров С. Д. Beneficial Properties of Enterococcus faecium Strains Isolated From Bats’ Fecal Samples Molecular Nutrition & Food Research, e70241 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.1002/mnfr.70241

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках реализации первого этапа проекта «Особенности иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных рукокрылых как основа прогнозирования новых инфекций» была получена черновая версия генома рыжей вечерницы (Nyctalus noctula) посредством секвенирования высокомолекулярной ДНК с применением технологий высокопроизводительного секвенирования второго (Illumina NovaSeq 6000) и третьего (PacBio HiFi) поколений для получения прочтений коротких (2х151 по) и длинных (10 000+ по) фрагментов ДНК и последующей гибридной сборкой данных. В результате нами был собран полный геном рыжей вечерницы размером 1.8 гигабазы в гаплоидном наборе со следующими параметрами: количество скаффолдов=1467, N50=10 мегабаз, L50=42, количество пропусков=0. По результатам качественной оценки полноты сборки генома с использованием алгоритма BUSCO и референсных баз данных генов класса млекопитающих и надотряда лавразиатерий было обнаружено 95% генов ортологов. Данные показатели качества сборки генома соответствуют стандартам консорциума Bat1K по сборке генома, а также общемировым стандартам качества сборки полных геномов млекопитающих. Также нами была проведена первичная аннотация полученного генома с использованием алгоритма TOGA и геномов человека и мыши в качестве референсов. В рамках следующего этапа реализации проекта будут продолжены биоинформатические работы по улучшению показателей качества сборки геномов и получению консенсусной аннотации генов с использованием транскриптомных данных. При морфометрическом анализе гистологической структуры органов иммунной системы у активных и гибернирующих рыжих вечерниц выявлены статистически значимое увеличение количества адипоцитов (p=0.009) в красном костном мозге грудины у гибернирующих рукокрылых, что связано с накоплением жировых запасов у этих животных. Также было выявлено статистически значимое снижение (p=0.028) содержания гемопоэтической ткани, что свидетельствует о снижении процессов кроветворения у гибернирующих рукокрылых. При этом у гибернирующих животных также наблюдалось статистически значимое (p=0.006) увеличение массы селезенки, что сопровождалось статистически значимым снижением (p-value=0.009) площади белой пульпы за счёт увеличения красной пульпы и статистически значимым уменьшением площади паренхимы (p=0.016) с одновременным увеличением кровенаполнения органа (p=0.047). Также при анализе гистологических срезов селезенки было обнаружено статистически значимое накопление гемосидерина (p=0.028) и снижение количества тучных клеток как в белой пульпе (p=0.0162), так и в зоне красной пульпы (p=0.009). Помимо этого, в рамках гистологического анализа лимфатических узлов было выявлено меньшее количество фолликулов и отсутствие Пейеровых бляшек у гибернирующих животных. Данные результаты свидетельствуют о значительном снижении активности иммунной системы у гибернирующих летучих мышей и демонстрируют конкретные физиологические механизмы адаптации организма летучих мышей к гибернации, которые будут подтверждены в ходе реализации следующего этапа проекта данными транскриптомного секвенирования. Также в рамках выполнения исследований II этапа было определено статистически значимое снижение (p<0.001) альфа разнообразия кишечных микроорганизмов и статистически значимые изменения (p≤0.002) в структуре микробных сообществ по бета разнообразию у гибернирующих рукокрылых на основании данных высокопроизводительного секвенирования V3-V4 16S рРНК. При этом статистически значимых различий между активными рукокрылыми до и после гибернации не наблюдалось. При сравнительном анализе данных реализации I этапа проекта, где разнообразие кишечных бактерий оценивалось методами культивирования и масс-спектрометрической идентификацией кишечных изолятов, было выяснено, что структура и разнообразие бактериальных сообществ рукокрылых возвращается к исходным значениям после гибернации в течение одного месяца. Также дифференциальный анализ изобилия бактериальных таксонов по 16S рРНК позволил определить статистически значимую (p<0.001) доминацию Peptostreptococcaceae и Clostridium sensu stricto 1 (облигатные анаэробы) в кишечной микробиоте гибернирующих рукокрылых и статистически значимое (p<0.001) повышенное изобилия Enterobacteriaceae, Lactococcus, Pediococcus и Enterococcus (факультативные анаэробы). Эти результаты свидетельствуют о том, что во время гибернации в кишечнике рукокрылых создаются более благоприятные условия для облигатно анаэробных бактерий, которые замещают нишу факультативных анаэробов. Подобные композиционные сдвиги сообществ кишечных бактерий сопровождались статистически значимым (p<0.001) повышением изобилия бактериофагов семейств Autographiviridae, Kyanoviridae, Straboviridae и Drexlerviridae в кишечной микробиоте гибернирующих рукокрылых, обнаруженном благодаря метавиромному секвенированию. Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение альфа разнообразия бактериальных сообществ помимо изменяющихся условий среды при гибернации хозяина опосредовано повышенной активностью бактериофагов. Доминацию бактериофагов в структуре кишечной микробиоты у гибернирующих рукокрылых возможно использовать как источник новых природных антимикробных препаратов на основе бактериофагов с уникальными свойствами. Также в рамках метавиромного анализа нами был выявлены и собраны геномы денсовирусов, которые на 99% гомологичны с Parus major densovirus, идентифицированном у большой синицы в 2014 году в Китае. Вирусы рода Densovirus поражают насекомых, которыми питаются рукокрылые и птицы, и генетический материал этих вирусов мог попасть в данные метавиромного анализа образцов фекалий животных из-за непереваренных остатков насекомых. Однако Parus major densovirus, который гомологичен вирусам идентифицированным у рукокрылых, продемонстрировал возможность заражения клеток легкого большой синицы, что указывает на то, что летучие мыши также могут быть хозяевами этого вируса. Результаты нашей работы демонстрируют неочевидно большее вовлечение рукокрылых в глобальную микробную экологию и Единое Здоровье, поскольку они могут быть переносчиками вирусов насекомых. Результаты реализации II этапа проекта в совокупности демонстрируют детальные механизмы изменения физиологии иммунной системы и структуры кишечного микробиома у гибернирующих рукокрылых. Результаты реализации II этапа проекта опубликованы в отечественном журнале Микробиология (Q3, Impact Factor 1.3), а также представлены на международных конференциях по микробиоте и молекулярной иммунобиологии. На данный момент результаты проекта отображены в двух публикациях в журналах Q1 и одной публикации в журнале Q3, две рукописи находятся на рецензии в журналах Q1-2. Таким образом, заявленные в рамках II этапа проекта исследования выполнены в полном объеме и широко представлены на международном уровне.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках реализации III этапа работ по проекту «Особенности иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных рукокрылых как основа прогнозирования новых инфекций» завершена сборка и аннотация финальной версии генома рыжей вечерницы (Nyctalus noctula) референсного качества. Итоговая сборка длиной ~1,81 Гб характеризуется очень высокими показателями целостности и полноты: она включает 818 скаффолдов, при этом половина генома (N50 ≈ 107,5 Мб) приходится всего на 6 самых крупных скаффолдов (L50 = 6), сопоставимых по размеру с хромосомами; показатель N90 составляет ~46–47 Мб, а доля пропусков не превышает 0,03 % позиций. По оценке BUSCO (набор laurasiatheria_odb12) финальный геном содержит 98,2 % полноценных генов-ортологов (97,3 % — в виде одиночных копий и 0,9 % — дуплицированные), что соответствует уровню современных референсных геномов млекопитающих. Структурная аннотация, выполненная с помощью пайплайна BRAKER3 с использованием транскриптомных и протеомных данных, позволила получить компактный и биологически реалистичный набор из ~17,7 тыс. генов и ~23,3 тыс. транскриптов, сформировав фундамент для последующих сравнительно-геномных и функциональных исследований иммунной системы рукокрылых. Данные результаты не уступают современным референсным сборкам консорциума Bat1K и по ряду ключевых метрик соответствуют или превосходят их пороговые требования, что свидетельствует о сформированных в отечественной лаборатории компетенциях по получению и аннотированию референсных геномов млекопитающих, снижении зависимости от зарубежных референсов и создании прочной инфраструктуры данных для последующих исследований иммунной системы, микробиоты и зоонозных инфекций у рукокрылых на базе ДГТУ. Для изучения молекулярных механизмов перестройки иммунной системы при гибернации был проведён дифференциальный анализ экспрессии генов в центральных и периферических органах иммунитета рыжей вечерницы. С использованием высококачественных транскриптомных данных (20 образцов РНК селезёнки и тимуса активных и гибернирующих животных) и пакета DESeq2 проанализирована экспрессия более 16 тыс. генов. Выявлено свыше 2,2 тыс. статистически значимо дифференциально экспрессирующихся генов между активным состоянием и гибернацией, причём сопоставимые по числу наборы генов демонстрируют повышение экспрессии либо у активных животных, либо у гибернирующих. На основе многоуровневой функциональной аннотации (DIAMOND, eggNOG-mapper, KEGG, GO) сформирован перечень из 130 иммунных генов с достоверными изменениями экспрессии. Показано, что в период гибернации происходит системное «приглушение» адаптивного и провоспалительного звеньев иммунитета (снижение экспрессии рецепторов цитокинов, компонентов Т-клеточного рецептора, Fc- и Ig-зависимых путей) при одновременном усилении стресс-защитных и «уборочных» функций макрофагов и антиоксидантных систем. В отчётном периоде также изучены функциональные свойства отдельных кишечных изолятов рукокрылых, в первую очередь штаммов Enterococcus faecium, полученных из фекалий рыжей вечерницы. Показано, что часть штаммов обладает выраженной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий (включая Listeria monocytogenes), устойчивыми к колебаниям pH и температуры антимикробными факторами белковой природы, развитым ферментативным профилем и благоприятными поверхностными свойствами при отсутствии ключевых факторов вирулентности и опасных паттернов антибиотикорезистентности. Эти штаммы рассматриваются как перспективные кандидаты для дальнейшей разработки пробиотических и защитных культур в ветеринарии и пищевой промышленности. Побочным, но принципиально важным результатом анализа метагеномных данных кишечника рукокрылых стало создание открытого биоинформатического инструмента для анализа микробирмеых данных KEGGaNOG - лёгкого Python-пакета для профилирования KEGG-модулей на основе аннотаций eggNOG-mapper. В ходе выполнения III этапа проекта опубликовано четыре научные статьи в журналах Q1 (International Journal of Molecular Sciences, Impact Factor 4.9; Veterinary Sciences, Impact Factor 2.3; и Molecular Nutrition & Food Research, Impact Factor 4.2) и одна научная статья в журнале Q3 (Brazilian Journal of Microbiology, Impact Factor 1.9). На момент сдачи отчёта по III этапу реализации проекта подгатавливаются к публикации ещё несколько рукописей в журналах Q1-Q2 и проводится полировка результатов сборки и аннотации генома рыжей вечерницы для их депонирования в отечественных и междунардных генетических баз данных. Результаты проекта также были широко освещены на международной научной арене в рамках научных конференций в Монголии, Бразилии и Ираке.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта обладают значительным потенциалом практического использования: полученный референсный геном рыжей вечерницы с детальной аннотацией кластеров генов иммунной системы и мультиомный анализ перестройки иммунитета при гибернации формируют современный научно-технологический задел для отечественных исследований зоонозных инфекций, разработки новых подходов к мониторингу, прогнозированию и профилактике вспышек новых возникающих (эмерджентных) инфекций у рукокрылых и других синантропных животных на территории Российской Федерации; выявленные штаммы кишечных бактерий Enterococcus faecium с выраженной антагонистической активностью и безопасным профилем могут служить основой для создания новых пробиотических и защитных культур для пищевой промышленности и ветеринарии, способствующих повышению биобезопасности продуктов, снижению нагрузки антибиотиков и, как следствие, снижению рисков распространения антибиотикорезистентности; разработанный открытый биоинформационный инструмент KEGGaNOG представляет собой прикладное программное обеспечение для функционального анализа микробиомных и геномных данных, полностью работающее офлайн и не требующее лицензий KEGG, что повышает технологический суверенитет российских лабораторий, снижает зависимость от зарубежной инфраструктуры и может быть внедрено в работу научных и прикладных центров (медицина, ветеринария, экология, контроль качества пищевой продукции); результаты мультиомных исследований микробиоты и иммунной системы рукокрылых создают основу для разработки новых индикаторов эпидемиологического надзора за резервуарами инфекций и принятия управленческих решений в сфере санитарно-эпидемиологического благополучия, что в совокупности способствует укреплению биологической безопасности, развитию отечественных биотехнологий и подготовке высококвалифицированных кадров в области иммунобиологии, микробиологии и биоинформатики.