Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В соответствии задачами проекта, работы в 2024 году проводили параллельно по трем блокам исследований: синтетический блок, блок физико-химических исследований и молекулярно-биологический блок. В результате выполнения работ синтетического блока осуществлен синтез новых олигонуклеотидных производных оксазольного (и частично тиазольного) ряда и начато изучение их свойств. В блоке физико-химических и молекулярно-биологических исследований изучены свойства как предложенных в 2023 г. производных олигонуклеотидов, содержащих межнуклеозидные N-кофеиновую, -нафтоимидазольную, -тетрафторпиридиновую и -5-нитро-бензимидазольную фосфорамидные группы, так и новых, впервые синтезированных в 2024г. Разработаны методы синтеза и получены четыре новых полициклических азида: N-нафтооксазольный, N-хлорнафтооксазольный, 5-хлор-бензоксазольный, 5-бром-нафтотиазольный - потенциальных модификатора олигонуклеотидов. Наработаны азиды в достаточных количествах для синтезов. Показана возможность реакции полученных новых азидов с трехвалентным фосфором (реакция Штаудингера) на модельных соединениях. С их использованием показана возможность и высокая эффективность синтеза четырех типов новых производных олигонуклеотидов в ходе автоматического твердофазного амидофосфитного синтеза. Олигонуклеотиды после синтеза охарактеризованы методами гель-электрофореза, ОФ ВЭЖХ и масс-спектроскопии. Синтезированы наборы олигонуклеотидов (70 модифицированных и 9 нативных) в количествах, необходимых для проведения физико-химических и молекулярно-биологических исследований. Изучены оптические свойства новых олигонуклеотидных производных с использованием метода оптической и флуоресцентной спектроскопии. Определены коэффициенты экстинкции от фосфорамидных групп в составе олигонуклеотидов. Установлено, что нафтооксазольные, хлорнафтооксазольные и 5-бром-нафтотиазольные производные обладают значимой флуоресценцией, которая резко возрастает в щечных условиях. Изучены гибридизационные свойства и структура комплексов новых олигонуклеотидных производных. Установлено, что введение одной модификации в 8-10-звенный олигомер снижает его температуру плавления с ДНК или РНК до 7 градусов в расчете на одну модификацию в зависимости от типа модификации, ее положения в цепи и типа комплементарной цепи. Введение модификаций в структуру ДНК/ДНК или ДНК/РНК дуплексов незначительно влияет на их вторичную структуру. Установлено, что значения рКа модифицированных фосфорамидных групп лежат в диапазоне 6.5 – 8.2. Методами молекулярного моделирования и анализа показано, что введение модификаций незначительно изменят пространственную структуру двойной спирали НК. Наблюдается несколько увеличенная конформационная подвижность концевых пар дуплекса в случае бензоксазольных и слегка сниженная для нитробензимидазольных олигонуклеотидов. Исследованы субстратные свойства олигонуклеотидных производных по отношению к Taq ДНК-полимеразе. Показана возможность и эффективность удлинения Taq ДНК-полимеразой модифицированных олигонуклеотидов, несущих кофеиновую, тетрафторпиридиновую, нафтоимидазольную или нитробензимидазольную модификацию в различных положениях праймера и матричной цепи. Эффективность удлинения праймеров зависит одновременно от типа модификации и ее положения вблизи 3’-конца праймера. Полученные данные указывают на то, что среди исследованных в 2024г., наиболее перспективными являются нитробензимидазольные или нафтоимидазольные олигонуклеотиды. Показано, что модификация фосфатных остатков значительно снижает скорость деградации ДНК цепи под действием нуклеаз сыворотки, причем введение большего числа модификаций увеличивает стабильность модифицированных олигомеров. Кроме того, показана возможность рекрутирования РНКазы Н гибридными РНК/ДНК комплексами, содержащими нитробензимидазольные производные олигонуклеотидов. Таким образом, синтезирован и охарактеризован ряд новых азидов для введения в структуру олигонуклеотидов с использованием реакции Штаудингера в рамках автоматического твердофазного фосфитамидного синтеза. С их использованием синтезировано четыре новых типа производных олигодезоксирибонуклеотидов, несущих модифицированные фосфатные остатки. Для синтезированных аналогов нуклеиновых кислот, как новых, так и предложенных нами ранее, изучены физико-химические и молекулярно-биологические свойства. Показана возможность использования разработанных производных в качестве праймеров. Полученные результаты показывают потенциал для применения разработанных нами фосфорамидных производных олигодезоксирибонуклеотидов в системах молекулярной диагностики и в качестве элементов терапевтических нуклеиновых кислот.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году в рамках реализации проекта, поддержанного Российским научным фондом, исследования проводили параллельно по трём взаимосвязанным блокам: синтетическому, физико-химическому и молекулярно-биологическому. Основное внимание было сосредоточено на разработке и изучении свойств фосфорамидных производных нуклеиновых кислот тиазольного и оксазольного ряда, обладающих уникальными функциональными свойствами. I. Синтетический блок В отчетном периоде успешно завершены все запланированные синтетические задачи. Были разработаны и оптимизированы оригинальные методы синтеза азидов (поли)циклических соединений тиазольного и оксазольного ряда, включая 2-азидо-6-хлорбензоксазол (OCl), 2-азидо-6-метоксибензотиазол (SOM), 2-азидо-4,6-дифторбензотиазол (SF), а так же, полифторированный азид - азидотетрафтор-N-метилбензамид-BODIPY. Структура полученных соединений подтверждена методами ЯМР и ИК спектроскопии. Разработан спектрофотометрический подход для оценки реакционной способности азидов в реакции Штаудингера, позволяющий минимизировать расход реагентов. На основе синтезированных азидов получены модифицированные олиготимидилаты, включая впервые созданный представитель нового класса - полифторированный фосфорамидный олигонуклеотид. Установлено, что природа заместителя в бензольном кольце существенно влияет на выход и стабильность олигонуклеотидов. Условия автоматического синтеза оптимизированы для каждого нового производного нуклеиновых кислот. Наработаны азиды для синтеза олигонуклеотидов. С их использованием синтезированы, выделены и охарактеризованы наборы олигонуклеотидов для выполнения всех блоков проекта (более 110 различных олигонуклеотидов). II. Физико-химический блок Изучены оптические свойства новых производных олигодезоксирибонуклеотидов: зарегистрированы спектры поглощения в УФ- и видимом диапазоне, определены коэффициенты молярной экстинкции и изучены флуоресцентные свойства. Высокая интенсивность флуоресценции выявлена у нафтоимидо(окса)зольных и хлорнафтооксазольных производных; для олигонуклеотидов с нафтоимидазольной модификацией показана способность выступать в роли сенсоров для детекции AP-сайтов. Гибридизационные свойства олигомеров исследованы методом термической денатурации. Введение модификаций приводит к снижению термодинамической стабильности дуплексов. Эффект наиболее выражен при введении модификации в центральную часть последовательности и наблюдается для ДНК/ДНК и ДНК/РНК дуплексов. Для них B- и А-формы двойной спирали не изменялись, в том числе и при множественных модификациях (по данным спектроскопии кругового дихроизма). Определены значения рКа модифицированных фосфатных остатков, что важно для понимания их поведения в условиях использования. С целью проведения молекулярно-динамических (МД) расчетов созданы МД-библиотеки для семи новых модификаций имидо-, окса- и тиазольного ряда. Проведено моделирование 157 комплексов в явной водной оболочке (суммарная длина траекторий >20 мкс). Установлено, что модификации не нарушают глобальную структуру дуплексов. Для нафтоимидазол-содержащего ДНК дуплекса с AP-сайтом напротив модификации объяснены экспериментально наблюдаемые закономерности в изменении термостабильности поврежденного комплекса при введении модификации и флуоресценции модифицированного остатка. III. Молекулярно-биологический блок Исследованы субстратные свойства модифицированных олигонуклеотидов по отношению к Taq ДНК-полимеразе. Выявлены производные праймеров, перспективные для использования в аллель-специфичной ПЦР, а также модификации, совместимые с удлинением как на комплементарных, так и на мисматч-содержащих матрицах. Показано, что расположение модификации в матрице в зоне посадки полимеразы значительно влияет на эффективность удлинения праймера. Успешно протестировано бензоксазольное производное в АС-ПЦР для детекции мутации V617F в гене JAK2. Показано повышение специфичности в такой системе по сравнению с нативным праймером. Изучена устойчивость олигонуклеотидов к нуклеазам сыворотки: все модификации повышают стабильность в FBS, а ее степень варьируется в зависимости от типа модификации. Исследована способность дуплексов модифицированных ДНК с РНК рекрутировать РНКазу H. Расщепление РНК наблюдается для большинства модифицированных комплексов, хотя скорость деградации РНК снижается. Это показывает возможность использования разработанных производных нуклеиновых кислот в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Перспективным направлением дальнейших работ является разработка стереоселективных методов синтеза, что позволит контролировать биологическую активность отдельных стереоизомеров, исследование применения бензоазольных праймеров в реальных системах НК-диагностики, а также исследование разработанных производных в качестве терапевтических нуклеиновых кислот. Полученные результаты создают основу для рационального проектирования новых олигонуклеотидных зондов для решения задач молекулярной диагностики и создания терапевтических нуклеиновых кислот.