Разработка профилактической вакцины для предотвращения развития лейомиомы матки у пациенток, планирующих беременность

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-15-00069

НазваниеРазработка профилактической вакцины для предотвращения развития лейомиомы матки у пациенток, планирующих беременность

Руководитель Кузнецова Мария Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-108 - Иммунология

Ключевые слова лейомиома, противоопухолевая вакцина, антиген, онкомаркер, транскрипт, рекомбинантный

Код ГРНТИ76.03.39

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Лейомиома – доброкачественная опухоль матки, является одним из самых распространенных заболеваний: от нее страдает до 50% женщин детородного возраста и до 70% женщин в менопаузе. Узлы лейомиомы существенно снижают качество жизни пациентки. Особенно опасным наличие миом становится в период беременности. Иногда болезнь носит спонтанный характер, и миомэктомия узла позволяет добиться радикального излечения. Однако, у некоторых пациенток образование опухолей носит массовый и закономерный характер. В этом случае приходится многократно повторять оперативные вмешательства, что вызывает травматизацию матки и делает проблематичной планируемую беременность. Такие пациентки, доля которых составляет около 10% от направляемых на операцию, стоят перед выбором: и отказ от оперативного вмешательства по поводу лейомиом, и проведение многократных миомэктомий существенно осложняет зачатие и вынашивание, угрожает трудностями при родах вплоть до разрыва матки и повреждения внутренних органов. Выходом для пациенток с высоким генетическим риском развития лейомиом могло бы стать применение терапевтических средств. Однако, все существующие средства терапии лейомиом вызывают медикаментозную менопаузу и несовместимы с планированием беременности. В связи с изложенным целью настоящего проекта является разработка принципиально новых средств терапии лейомиомы матки, приемлемых для пациенток, планирующих беременность, а именно, профилактической вакцины. В 2022 г вышло исследование Maekawa et al, посвященное изучению особенностей профиля метилирования и экспрессии генома в узлах лейомиом с драйверными мутациями в генах MED12, HMGA2 и FH. Эти исследования расширили данные Navarro et al, 2012, Mehine et al, 2016 и Anjum et al, 2019. В результате стал доступен перечень маркерных генов, экспрессия которых происходит в клетках лейомиом, но отсутствует в клетках нормальных органов и тканей. Экспрессия этих генов необходима на этапах эмбрионального развития, а во взрослом организме они активируются только в опухолях. В качестве средства терапии лейомиом могли бы использоваться вакцины на основе белков, необходимых для возникновения и роста узлов лейомиом, но отсутствующих во взрослом организме. Принципиальным преимуществом таких вакцин является то, что применение препарата может проводиться до зачатия, а защитный эффект в виде способности вырабатывать антитела против белков-мишеней на клетках лейомиом будет проявляться уже в ходе беременности, когда применение любых медикаментозных средств ограниченно, а риск возникновения и быстрой прогрессии опухолей максимален. В работах Maekawa et al 2016 и Navarro et al. 2012 приводятся данные метатранскриптомных и метаметиломных исследований, согласно которым в клетках лейомиом наблюдается экспрессия ряда генов специфических маркеров, которые не функционируют ни в одном из типов нормальных тканей взрослого организма, но необходимы на стадии эмбрионального развития. К это категории можно отнести Satb2, Nrg1, PCP4, CHRDL2, MFAP2 в качестве универсальных маркеров, HMGA2, GRPR, PLAG1, PAPPA2 и MB21D2 в качестве маркеров лейомиом HMGA2-зависимого типа; ADAM12, MMP11, MMP16, RAD51B, THSD4 (Adamtsl6-β) и RUNDC1 в качестве маркеров лейомиом MED12-зависимого типа. Можно предположить, что эти белки, присутствующие в организме плодов, проникают в организм матери и вызывают иммунизацию. Возможность создания профилактических противоопухолевых вакцин подтверждается экспериментальными данными. В статье Peruzzi et al 2009 на модели мыши в качестве основы противоопухолевой вакцины использована матриксная металлопротеиназа MMP11 мыши, которая является важным специфическим маркером узлов лейомиомы MED12-зависимого типа. При этом была достигнута эффективная защита животных от развития опухолей толстой кишки. Известен пример успешных клинических испытаний вакцины на основе фактора Brachyuri – эмбрионального белка, участвующего в эпидермально-мезенхимальном переходе (DeMaria et al, 2021; Collins et al, 2020; Hamilton et al, 2013).

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Новые подходы к таргетной терапии и профилактике миомы матки Novel Approaches to Possible Targeted Therapies and Prophylaxis of Uterine Fibroids MDPI, Diseases 2023, 11, 156. (год публикации - 2023)
10.3390/diseases11040156

2. Нерсесян Е.А., Адамян Л.В., Акуленко Л.В., Кузнецова М.В., Асатурова А.В., Бадлаева А.С., Чернышенко Т.А., Ненахов Ф.В., Тоноян Н.М., Михайловская Г.В., Свирепова К.А., Раснер П.И., Трофимов Д.Ю. Гетерогенность молекулярного фенотипа опухоли при миоме матки. Сообщение II ПРОБЛЕМЫ РЕПРОДУКЦИИ , 2024;30(5):15‑24. (год публикации - 2024)
10.17116/repro20243005115

3. АДАМЯН Л.В., АКУЛЕНКО Л.В., НЕРСЕСЯН Е.А., КУЗНЕЦОВА М.В., ЧЕРНЫШЕНКО Т.А., НЕНАХОВ Ф.В., ТОНОЯН Н.М., МИХАЙЛОВСКАЯ Г.В., СВИРЕПОВА К.А., РАСНЕР П.И., ТРОФИМОВ Д.Ю. Гетерогенность молекулярного фенотипа при миоме матки. Сообщение I Проблемы рнпродукции, №4, том 30 (год публикации - 2024)
10.17116/repro202430041121

4. КУЗНЕЦОВА М.В, НЕРСЕСЯН Е.А., БУРМЕНСКАЯ О.В., ТОНОЯН Н.М., МИХАЙЛОВСКАЯ Г.В., СВИРЕПОВА К.А., АДАМЯН Л.В., ТРОФИМОВ Д.Ю. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ТКАНЯХ МИОМАТОЗНЫХ УЗЛОВ Акушерство и Гинекология, №8, 2024 (год публикации - 2024)
10.18565/aig.2024.72

5. КУЗНЕЦОВА М.В., ШЕВЕЛЕВ А.Б., ПОЗДНЯКОВА Н.В., САМОЙЛОВА Д.В., КАРЯГИНА В.Е., ТОНОЯН Н. М., ТРУБНИКОВА Е.В., ЗЕЛЕНСКИЙ Д.В., ВИШНЯКОВА П. А. Исследование белка PCP4 как потенциального опухолевого маркера лейомиомы матки Акушерство и гинекология, 2025; 8: 159-171 (год публикации - 2025)
10.18565/aig.2025.171

6. Акуленко Л. В., Нерсесян Е. А., Кузнецова М. В., Адамян Л. В. Профилирование дифференциальной экспрессии генов в миоматозных узлах и миометрии при первичной и рецидивной миоме матки МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА, 24, № 8 :29-31 (год публикации - 2025)
10.25557/2073-7998.2025.08.29-31

7. Рогожина А. C., Badlaeva А.В., Tregubova А. Н., Асатурова А. В. , Кузнецова М. В., Сухих Г. Т. Diagnostic Value and Interobserver Reproducibility of Histopathological Features in Fumarate Hydratase-Deficient Uterine Leiomyomas Diagnostics, 15(23), 3006 (год публикации - 2025)
10.3390/diagnostics15233006

8. КУЗНЕЦОВА М.В., ТОНОЯН Н. М., АСАТУРОВА А.В., БАДЛАЕВА А.С., КАРЯГИНА В.А., АДАМЯН Л.В. Встречаемость и разнообразие соматических мутаций в гене MED12 при множественной миоме матки Проблемы репродукции (год публикации - 2026)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Лейомиомы являются доброкачественными опухолями, возникновение которых, в большинстве случаев, не угрожает жизни пациентки. Тем не менее, распространенность лейомиоматоза – им страдает до 50% женщин детородного возраста и до 70% женщин в менопаузе – придает борьбе с этим заболеванием высокую социальную значимость. Узлы лейомиомы существенно снижают качество жизни пациентки: вызывают боли, постоянные кровотечения, вызывают обструкцию внутренних органов. Но особенно опасным наличие миом становится в период беременности. Они механически препятствуют зачатию и росту плодного пузыря. Под действием прогестерона, концентрация которого сильно возрастает в период беременности, их рост в этот время резко ускоряется. В результате узлы лейомиом вызывают деформацию матки и формируют спайки с соседними органами, нарушающие растяжение органа во время вынашивания и его сокращения во время родов. Именно во время беременности и родов лейомиомы часто создают непредвиденные проблемы вплоть до жизнеугрожающих состояний (разрыв матки), которые могут потребовать прерывания беременности или преждевременного кесарева сечения. При определенных типах наследственности рецидивирующее возникновение новых узлов лейомиом делает успешное окончание беременности практически невозможным. Таким образом, создание эффективного средства профилактики лейомиом является необходимым условием деторождения для 5% потенциальных матерей. Исполнителями проекта была высказана гипотеза о возможности создания профилактической вакцины для снижения интенсивности рецидивирования лейомиоматоза у женщин детородного возраста. Гипотеза основана на результатах статистического исследования, показавшего сниженный риск возникновения лейомиом у женщин, имеющих 5 и более детей. Мы предположили, что этот эффект обусловлен иммунизацией матерей антигенами плода, который усиливается при многократной реиммунизации, которой подвергаются многодетные матери. Гипотеза была частично проверена путем анализа опубликованных данных протеомных и транскриптомных исследований узлов лейомиом, которые позволили выявить 6 онкомаркеров, характерных для лейомиом, которые представляют собой эмбриональные белки, полностью отсутствующие во взрослом организме. В рамках проекта эти шесть антигенов Satb2, Pcp4, Wif1, Mmp11, Mmp16 и Adam12 кроличьего происхождения были наработаны в E. coli и использованы для иммунизации кроликов. Было показано, что против всех шести антигенов могут быть получены высокие титры антител, что, однако, не приводит к возникновению у иммунизированных животных патологий аутоиммунной этиологии. Таким образом, получены доказательства того, что все белки-кандидаты не подвержены действию системы индукции толерантности к аутоантигенам, и они могут рассматриваться в качестве кандидатов для испытания в качестве вакцинных субстанций. Одновременно были проведены эксперименты по непосредственному выявлению в сыворотках крови много рожавших женщин антител к белкам-онкомаркерам лейомиом. Для этого был использован метод иммуноблоттинга с использованием материала узлов лейомиом, предварительно разделенных с помощью двумерного электрофореза. В качестве сывороток сравнения использовались сыворотки пациенток с узлами лейомом Med12+ и Med12- типов, а также сыворотки мужчин, которые не имеют вероятности контакта с материалом узлов лейомом. Были выявлены белки-кандидаты с молекулярными массами 71, 60, 53, 48, 46 и 45 кДа, которые на правлены на идентификацию с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Исследования методом MALDI-TOF после обработки белков трипсином позволили сформировать следующий перечень белков-кандидатов, которые могут рассматриваться в качестве высокоспецифичных онкомаркеров лейомиом: Название GenBank Acc # MW Описание FUBP2 Q92945 73,114 Far upstream element-binding protein 2 Эмбриональный фактор транскрипции, есть только в недифференцированных клетках LPP Q93052 65,746 Lipoma-preferred partner Транскрипционный фактор, ген содержит точку перестройки генома, активирующуюся в доброкачественных липомах DPYL3 Q14195 61,963 Dihydropyrimidinase-related protein 3 Фактор роста аксонов, фосфопротеин, экспрессируется в сердце и скелетных мышцах, головном мозге, поджелудочной железе, почках, печени и плаценте PALLD Q8WX93 150,56 Palladin Гомолог коннектина, экспрессируется в яичка, яичниках и ободочной кишке FINC P02751 272,32 Fibronectin ACTH P63267 41,876 Actin, gamma-enteric smooth muscle XRCC6 P12956 69,842 X-ray repair cross-complementing protein 6 ДНК-связывающий белок (возможно, хеликаза)), аутоантиген комплекса р70/р80, против которого образуются антитела при СКВ, болезни Гревса и других аутоиммунных заболеваниях EF2 P13639 95,337 Translation elongation factor 2 PRELP P51888 43,809 Prolargin Белок опухолевой капсулы, продуцируется опухолевыми фибробластами, участвует в аномальном ремоделировании ЦНС DDX1 Q92499 82,431 ATP-dependent RNA helicase DESM P17661 53,535 Desmin Белок мышчных промежуточных филаментов, входит в Z-диски, отвечает со соединение дисков с плазматической мембраной PP1R7 Q15435 41,564 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7 Фосфопротеин, регулятор транскрипции, экспрессируется во всех тканях человека K1C18 P05783 48,057 Keratin, type I cytoskeletal 18 LUM P51884 38,429 Lumican Малый интерстициальный протеогликан, входит в ЕСМ миокардаа, аорты, скелетных мышц, межпозвоночных дисков ITIH1 P19827 101,39 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 LMNA P02545 74,139 Prelamin-A/C Белок ядерной мембраны, имеет домен, связывающий промежуточные филаменты TES Q9UGI8 47,996 Testin Онкосупрессор, работающий путем подавления транскрипции генов-мишеней в результате метилирования CpG-островков

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Миома матки является одним из наиболее социально значимых заболеваний женской репродуктивной системы ввиду широкой распространенности, малоизученности этиологии и патогенеза, отсутствия универсальных методов лечения и профилактики. Миома матки диагностируется у 25-75% женщин в репродуктивном периоде, при этом 5-10% случаев бесплодия у женщин репродуктивного возраста связывают с наличием миомы матки, что часто ведет к необходимости хирургического вмешательства. Кроме того, при крупных и множественных миомах может возникнуть необходимость полного удаления матки, что лишает женщину возможности реализовать репродуктивную функцию. Миома матки представляет собой доброкачественную опухоль, формирующуюся из миоцитов миометрия. В настоящее время не вызывает сомнений многофакторная природа этой опухоли, обусловленная кумулятивным эффектом генетических и средовых факторов. В нашей работе основное внимание уделялось молекулярно-генетическим основам патогенеза миомы матки и поиску новых антигенов, на основе которых можно было бы разработать новый метод профилактики развития и рецидивирования миоматозных узлов. В рамках выполнения проекта были проведены исследования по проверке пригодности в качестве перспективных белков для разработки вакцины против лейомиоматоза двух ранее охарактеризованных кандидатных антигенов человека (PCP4 и MMP11), рекомбинантные продуценты которых были получены с помощью клонирования в E. coli. Полученная картина межгрупповых различий говорит о клинико-диагностической значимости исследования и подтверждает, что интенсивность реакции сывороток с белком Mmp11 может служить дифференциальным диагностическим признаком для различения исследуемых групп пациентов, тогда как для белка Pcp4 результаты оказались негативными – наибольший ответ дали сыворотки контрольной группы (мужчины). Для дальнейшего поиска кандидатных антигенов образцы белков, выделенных из миоматозных узлов, после иммуннопреципитации с сыворотками многодетных женщин были переданы на анализ методом ВЭЖХ-МС/МС. Наиболее перспективными кандидатами на иммуногенные белки, пригодные для дальнейших исследований, оказались виментин (Vim) и десмин (Des), поэтому для каждого из этих антигенов были созданы плазмидные ДНК-конструкции, позволившие получить рекомбинантные белки виментин (Vim) и десмин (Des) в клетках E. coli. Для рекомбинантных белков десмин и виментин было проведено пилотное исследование на 19 образцах сывороток крови предельного титра антител с использованием непрямого иммуноферментного анализа. Сыворотки крови многодетных матерей показали иммунореактивность в отношении этих белков. Методами ИГХ были проведены иммуногистохимические исследования миоматозных узлов редкого подтипа – лейомиом с дефицитом фумаратгидратазы (FH). Молекулярный статус определяли методом иммуногистохимического окрашивания для определения фумаратгидратазы (FH) и S-(2-сукцино)-цистеина (2SC). Наличие/отсутствие в исследованных миоматозных узлах соматических мутаций в гене MED12 определяли методом амплификации экзона 2 с последующим секвенированием по Сэнгеру. Тип каждого миоматозного узла определялся путем секвенирования по Сэнгеру экзона 2 гена MED12, с помощью иммуногистохимического окрашивания белка HMGA2 в образцах ткани узлов, либо с помощью количественной ОТ-ПЦР, выявляющей содержание транскрипта гена HMGA2. Биаллельную инактивацию гена фумаратгидратазы (FH) в ткани узла выявляли с помощью окрашивания методами ИГХ. Последний тип миом довольно редко встречается, при этом часто ошибочно диагностируется как злокачественная лейомиосаркома. В нашей работе с помощью ИГХ и анализа клеточной структуры с помощью микроскопии удалось выделить критерии, позволяющие надежно отличать эти две нозологии с принципиально разными прогнозами. Полученные результаты подтвердили гипотезу о возможности создания профилактической вакцины для снижения интенсивности рецидивирования лейомиоматоза у женщин детородного возраста. В качестве антигена, на основе которого такая вакцина может быть создана, предложен белок Mmp11, прошедший тестирование на сыворотках крови многодетным матерей.

Публикации