Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На втором этапе выполнения проекта в 2024 году на основе транскриптомного анализа гранулёзных клеток женщин с СПКЯ и без, анализа их дифференциальной экспрессии, а также результатов анализа данных, полученных в 2023 году по гранулезоподобной клеточной линии KGN по данным FANTOM5, и данных из источников мировой литературы и баз данных, были отобраны следующие днРНК: MALAT1, NEAT, PVT1, CTBP1-AS, H19, SRA и HCG26 для поиска мишеней РНК-терапии. Валидация уровней экспрессии этих днРНК в ГК методом ПЦР-РВ показала, что у женщин с СПКЯ значительно повышена экспрессия генов MALAT1, CTBP1-AS и SRA, а экспрессия днРНК PVT1 и HCG26 не отличалась от контрольной группы. При этом в сыворотке крови у женщин с СПКЯ уровень экспрессии гена MALAT1 был ниже, чем в контроле. Также была изучена экспрессия белок-кодирующего гена CYP19A1, ассоциированного с СПКЯ по данным полученным нами в ходе транскриптомного профилирования и по данным литературы, которая была значительно понижена в гранулёзных клетках при СПКЯ. Многофакторный анализ 41 показателя (Метаболических: ФСГ, ЛГ, ЛГ/ФСГ, Пролактин, ТТГ, Т3св, Кортизол, АКТГ, Е2, Пролактин, Тестостерон, ДГЭАс17-ОН, ДГЭА, АМГ, ИФР-1, АТ-ТПО, С-пептид, Инсулин, Глюкоза, HOMA-IR, BMP15. Репродуктивных: Антральные фолликулы (AFC), Пунктированные фолликулы, Ооциты M1, Ооциты M2. Оксидативного статуса: СОД, ЦП, СПА, МДА, ГЛХЛ, Экспрессии генов MALAT1, PVT1, CTBP1-AS, SRA и HCG26. Полиморфных локусов: (rs4880) CYP19, (rs726547) CAT, (rs1001179) CYP17, (rs743572) GPX4, (rs713041) GSTP1, (rs1695) MALAT1, C>T NEAT) позволил разделить женщин с СПКЯ на 2 подгруппы: с метаболическими изменениями и репродуктивными. Ведущими факторами в группе с метаболическими изменениями были AMГ и Прогестерон, в группе с репродуктивными нарушениями - Oocytes total, Oocytes М2, Punctured follicles, а также уровни гормонов Прогестерон, Тестостерон общ, E2/T. Уровень экспрессии исследуемых днРНК в ГК не отличался по вариабельности в этих подгруппах у женщин с СПКЯ. Наиболее высокую ассоциативность с СПКЯ показал полиморфный локус гена CYP19A (rs726547) в обеих фенотипических подгруппах (метаболической и репродуктивной). Методом MDR установлена 7-локусная модель межгенного взаимодействия, обусловливающая предрасположенность к СПКЯ. Выявлены эпистатические взаимодействия между полиморфными вариантами генов SOD2 (rs4880) и GPX4 (rs713041), и между CYP17A1 (rs743572) и GSTP1 (rs1695). Для прогнозирования риска СПКЯ была выбрана модель, которая максимизировала точность тестирования 95%. Интерактомная модель взаимодействий lncRNA-микроРНК-мРНК включила 3 микроРНК (hsa-miR-652-3p, hsa-miR-181a-2-3p, hsa-miR-193b-3p), 35 днРНК (BAIAP2-DT; BET1-AS1; CAMTA1-AS2; ERVK9-11; GABPB1-AS1; GABRG3-AS1; GAS6-AS1; GDNF-AS1; GLIDR; GRIK1-AS1; H19; HS1BP3-IT1; IL6R-AS1; KCNMA1-AS3; LERFS; LINC00707; LINC01291; LINC01355; LINC01502; LINC01659; LINC01807; LINC02019; LINC02145; LINC02186; LINC02299; LINC02732; LINC02830; NCAM1-AS1; PAX8-AS1; PHEX-AS1; PLAC4; SLC9A3-AS1; SPATA13-AS1; ST8SIA6-AS1; ZNF571-AS1.) и 135 мРНК (гены которых в большей степени по своей функциональной значимости по результатам GO и KEGG анализов относились к сигнальным путям клеточных рецепторов). Нами отработаны методики модельных экспериментов на культуре гранулёзных клеток для изучения функций днРНК. Получены предварительные данные об их изменении экспрессии отобранных нами днРНК в гранулёзных клетках при добавлении в среду глюкозы или инсулина. Материалы исследований в 2024 году были представлены:  На Международном конгрессе "VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки высшей школы", Саратов, 14-19 июня 2024 (очно);  XVII Региональном научно-образовательном форума «Мать и Дитя» и Пленума Правления РОАГ, Волгоград, 26-28 июня 2024. (заочно);  На 14 Международной мультиконференции "Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология", Новосибирск, 5-10 августа 2024 (заочно);  II Всероссийской конференции имени В.С. Баранова «ПОЭЗИЯ ГЕНОМА» с международным участием, Санкт-Петербург, 6–10 ноября 2024 (приглашенный доклад онлайн);  Международном симпозиуме «Геномные технологии и геномная медицина», Ереван, 16-17 декабря 2024 г. (приглашённый пленарный доклад, очно). По теме проекта в 2024 году исполнителем проекта Али Руба успешно защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, студентами кафедры генетики Южного федерального университета защищены магистерские диссертации. Опубликовано 9 публикаций в журналах с учетом квартилей по результатм проекта, полученных в 2024 г., одна статья подготовлена для печати в журнале индексируемом в Scopus Q1 ("Nonсoding RNA"). В том числе с участием трёх студентов ЮФУ опубликовано 2 статьи.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году в ходе выполнения проекта была создана и охарактеризована in vitro модель метаболического/гормонального стресса (глюкоза/инсулин) в клеточной линии KGN. Получены условия моделирования метаболического стресса без выраженной цитотоксичности, которые подходят для транскрипционных измерений. Определены пределы применимости модели оксидативного стресса (H₂O₂) из-за цитотоксичности. Экзогенная H₂O₂ снижает жизнеспособность клеток дозозависимо. Проведены исследования по изучению экспрессии 5 lncRNA (SRA1, PGR-AS1, TCONS_l2_00014567, LOC105377276, NTF3) в трансфицированных клетках KGN в ответ на повышенные концентрации глюкозы, инсулина и глюкозы+инсулин. Получены воспроизводимые транскрипционные эффекты для двух изоформ гена SRA1 при добавлении в среду глюкозы и/или инсулина. Эффект индукции SRA1 в присутствии инсулин+глюкоза выраженнее через 24 часа, чем через 48 часов, что интерпретировано как транзиентный ответ. LOC105377276 демонстрирует снижение транскрипции в ответ на добавление инсулина, при этом дозозависимость не выявлена. Для моделирования сетей взаимодействия генов для генерации сигнальных каскадов, которые соединяют регуляторные lncRNAs с их генными и белковыми мишенями в изучаемых группах и модельных экспериментах нами был сформирован каталог регуляторных элементов и полиморфных локусов (lncRNA/miRNA/SNP) вокруг генов фолликулогенеза и СПКЯ ассоциированных каскадов. Сформирован список из 33 белок кодирующих генов, связанных с гормональными рецепторами и путями PI3K AKT Foxo3a и PI3K AKT mTORC1, а также с регуляцией ароматазы в гранулёзных клетках, и выполнен их геномный анализ с использованием UCSC Genome Browser. В последовательностях и окрестностях этих генов выявлены: 20 lncRNA, 4 гена микроРНК, 121 сайт связывания микроРНК, а также 16 полиморфных локусов генов lncRNA. Показано, что обнаруженные полиморфные локусы генов lncRNA ассоциированы с репродуктивными признаками (как аргумент в пользу потенциальной функциональной значимости этих lncRNA в патогенезе СПКЯ). Из 33 белок кодирующих генов 24 оказались расположены рядом с lncRNA, рассматриваемыми как дифференциально экспрессирующиеся при СПКЯ; среди них 18 антисмысловых и 6 с бидирекциональными промоторами. В базе данных GTEx наличие экспрессии найдено для 11 из 24 lncRNA, однако только PACERR имеет уровень ≥1 TPM в репродуктивных тканях. По FANTOM5 promoterome view выявлены 5 потенциальных lncRNA, демонстрирующих экспрессию в KGN с rle≥5. Построены 4 цис регуляторные сети, включающие 3 гена, где 1 белок кодирующий + 2 lncRNA с бидирекциональным промотором и смысл/антисмысл перекрытием, и одна сеть из 2 генов (EREG и LOC105377276) только со смысл/антисмысл перекрытием. На основе совокупности наблюдений LOC105377276 обоснован как приоритетный кандидат для последующих тестов влияния инсулинорезистентности/метаболического стресса на транскрипционную программу кумулюсных клеток. Выполнен дизайн антисмысловых олигонуклеотидов для lncRNA при помощи доступных онлайн программ. Выполнен компьютерный скрининг siRNA на платформах DSIR и siDirect 2.1 (а также siExplorer, RNAxs), причём DSIR и siDirect 2.1 признаны наиболее пригодными. По заданным фильтрам отобраны оптимальные кандидаты siRNA: SRA1: UGUAUUACAUCACAUCUUCUG; NEAT1: UAACUCAGUCAUCUCUCCCUG; H19: CUUCUGAAUUUAAUUUGCACU; MALAT1: GCAGAGGCAUUUCAUCCUU. Разработаны методы доставки антисмысловых олигонуклеотидов в клетки KGN, нацеленных на специфичные lncRNA, экспрессирующиеся при СПКЯ. В экспериментах in vitro подтверждён стабильный нокдаун. Проведен сравнительный анализ липофекции для клеточной линии KGN и культуры гранулезных клеток различных производителей реагентов: PEI 40K (Китай), GenJect-40 (Россия), PEI (Россия). По критериям «эффективность нокдауна / токсичность» выбран производитель набора GenJect 40 как лучший. Оптимизирован протокол, при котором получены количественные эффекты: жизнеспособность 80±8,6% и нокдаун SRA1 до fold change 0,18 через 24 ч (≈ снижение в 5,5 раза) и до 0,22 через 48 ч (≈ снижение в 4,5 раза), что трактуется как стабильный нокдаун. Оптимизирована доставка siRNA в KGN и подтверждён стабильный нокдаун SRA1. После подавления SRA1 в KGN не выявлено влияния на уровни экспрессии FSHR и LHCGR. Аналогичный результат получен и в первичной культуре клеток кумулюса пациенток с СПКЯ. Отсутствие эффекта нокдауна SRA1 на FSHR/LHCGR не исключает терапевтической значимости SRA1, которая является регулятором ядерно-рецепторной сигнализации и может иметь широкий спектр downstream мишеней lncRNA. В 2025 году материалы исследований были представлены: на Международной конференции IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine (Китай) (онлайн, очно); Международной научно-практической конференции «INTERNATIONAL SCIENTIFIC & PRACTICAL CONFERENCE «GENETICS AND PHYSIOLOGY: PAST, PRESENT, FUTURE» (Алматы, Казахстан) (очно); XXXV Ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» Федеральная территория «Сириус» (очно); на студенческой «Неделе науки» Академии биологии и биотехнологии ЮФУ (Ростов-на-Дону) (очно). Исполнителем проекта О.В. Лянгасовой подготовлена диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук по теме: «Прогностическое значение генетических факторов и вклад их межгенных взаимодействий в формировании риска развития бедного овариального ответа в рамках программ вспомогательных репродуктивных технологий», получено заключение кафедры генетики об успешной апробации. Исполнителем проекта Ломтевой С.В. подготовлена диссертационная работа на соискание ученой степени доктора биологических наук по теме «Молекулярно-генетические механизмы патогенеза при синдроме поликистозных яичников у женщин с разным овариальным ответом в программах ЭКО», получено заключение кафедры генетики об успешной апробации. Студентами кафедры генетики ЮФУ в 2025 году защищены 2 магистерские диссертации по теме данного проекта. Защищена выпускная квалификационная работа бакалавра. В 2025 г было публиковано 7 публикаций в журналах с учетом квартилей и еще 3 статьи находятся на рецензии в журналах : Noncodig genome (Q1), Акушерство и гинекология (Q4); Медицинская генетика (К2). Ломтева С. В., Сагомонов А. С., Харченко Е. Ю. 2025. Роль микроРНК, регулирующих гены окислительного стресса, при синдроме поликистозных яичников. PREPRINTS.RU. https://doi.org/10.24108/preprints-3114011; Lomteva S. V. 2025. The role of long noncoding RNA H19 in the pathogenesis of polycystic ovary syndrome. PREPRINTS.RU. https://doi.org/10.24108/preprints-3114020.