Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Предметом исследования, проводимого в настоящем проекте является ядерный актин, который как известно представлен в ядре двумя изоформами β-, и γ-актином. При функционировании актин взаимодействует с большим числом белков, называемых актин-связывающими белками. На предыдущем этапе выполнения проекта с использованием биоинформатического анализа были охарактеризованы актин-связывающие белки, взаимодействующие с β-актином. Возникает вопрос, идентичны ли они актин-связывающим белкам, взаимодействующим с γ-актином и α-актином мышечных клеток. Актин один из самых распространенных и самых консервативных белков. Изоформы актина обладают высокой степенью идентичности последовательности (~ 93–99%) и структуры, однако различаются по локализации и функционированию. В то же время эти шесть изоформ актина кодируются различными генами. В ранних работах предполагалось, что шесть различных генов актина существует для большей устойчивости столь важного для организма белка. Однако в работах по нокауту генов различных изоформ актина было показано, что несмотря на то, что изоформы актина похожи по аминокислотному составу и по структуре, они слабо взаимозаменяемы. Оказалось, что нокаут одной изоформы актина приводит к повышению экспрессии других изоформ для поддержания постоянного количества актинового белка, однако этот суммарный балланс не приводит к полной функциональной компенсации. Ни одна из изоформ актина у мышей с нокаутированным β-актином, не может функционально компенсировать его потерю. Механизмы, которые поддерживают это функциональное различие между изоформами актина, неизвестны. Биоинформатический анализ показал, что интерактомы α-, β-, и γ-актина существенно различаются. Существуют актин-связывающие белки, взаимодействующие со всеми тремя изоформами актина или с парами изоформ, но существуют и белки, специфически взаимодействующие только с одной изоформой (только с α-, только с β-, и только с γ-актином). Основное различие изоформ актина заключается в специфике их функционирования, по этому же признаку различаются и их протеомы. Причем оказалось, что белки уникальные для β-актина участвуют в гораздо большем числе процессов, чем белки уникальные для других изоформ. В тоже время по структурным характеристикам белков интерактомы разных изоформ актина оказались близки. Полученные результаты хорошо согласуются с представлениями о том, что по крайней мере некоторые функции актина регулируются за пределами уровня аминокислот на уровне нуклеотидной последовательности. Mokin Y.I., Povarova O.I., Silonov S.A., Antifeeva I.A., Kipper A.I., Fonin A.V., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. “Bioinformatics analysis of proteins interacting with different actin isoforms” Biochemical and Biophysical Research Communications. (Ms. No.: BBRC-24-8850 принята к публикации. Письмо с Финальным решением в приложении Файл: BBRC-24-8850_ Final Decision. pdf Кроме того, получены новые данные о структуре инактивированного актина, который как предполагается, похож на короткие олигомеры ядерного актина. Ранее нами было показано, что, инактивированный актин, который образуется после перевода нативного актина в раствор с умеренной концентрацией денатуранта, после отщепления иона Са, или после прогревания, является монодисперсным ассоциатом и имеет одинаковые спектральные характеристики независимо от способа получения. Поскольку инактивированный актин состоит из 14-16 мономеров актина (т.е. его время вращательной релаксации существенно больше времени жизни возбужденного состояния триптофановых остатков), а триптофановые остатки недоступны молекулам растворителя и поэтому на основании перреновских зависимостей, построенных при изменении вязкости растворителя, нельзя было судить о внутримолекулярной подвижности инактивированного актина. Поэтому, чтобы определить параметры внутримолекулярной подвижности инактивированного актина на данном этапе работы была измерена время-разрешенная зависимость анизотропии его собственной флуоресценции. Оказалось, что внутренние триптофановые остатки инактивированного актина обладают подвижностью. С использованием динамического светорассеяния было показано, что инактивированный актин, полученный путем прогревания, имеет такие же размеры, как и в умеренных концентрациях денатуранта. Кроме того, в присутствии инактивированного актина существенно возрастает интенсивность флуоресценции гидрофобного зонда АНС. Таким образом, на данном этапе получено новое подтверждение того, что инактивированный актин является монодисперсным ассоциатом, что его размер не зависит от способа получения, и что инактивированный актин имеет уникальную структуру, существенно отличающуюся от структуры глобулярных белков с полярным ядром и гидрофобными кластерами на поверхности, причем внутренняя область инактивированного актина значительно менее подвижна по сравнению с ядром G-актина. Povarova O.I., Silonov S.A., Antifeeva I.A., Kipper A.I., Fonin A.V., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. New strokes to the portrait of inactivated actin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2024 Nov 28;741:151089. doi: 10.1016/j.bbrc.2024.151089

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На заключительном этапе выполнения проекта подведены итоги всех экспериментальных данных в ходе исследования механизмов образования, определения размеров и формы инактивированного актина in vitro. Ранее нами было показано, что актин, инактивированный гуанидингидрохлоридом в кон-центрации 1.5М является монодисперсным ассоциатом с гидродинамическим радиусом порядка 8 нм (PPL_1999). Согласно спектральным характеристикам, аналогичная структу-ра возникала при тепловой инактивации и в присутствии хелатирующих агентов, способ-ствующих удалению связанных молекул АТФ и ионов Са++. Объединяя данные SEC-SAXS с негативным окрашиванием в просвечивающем электронном микроскопе и ранее полу-ченными гидродинамическими данными, мы показали, что актин инактивированный нагреванием образует плоские дискообразные олигомерные «бусины» диаметром около 17 нм, поперечные размеры которых сопоставимы с ранее определенными для олигомеров I-актина. В результате экспериментов, выполненных методом SAXS было показано, что инактивированный актина может образовывать достаточно большие сильно вытянутые ча-стицы, в то же время результаты электронной микроскопии показали, что эти достаточно большие агрегаты состоят из отдельных, одинаковых по размеру частиц, «бусинок». На ос-новании совокупности результатов, полученных методами SEC-SAXS и электронной мик-роскопии впервые предложена модель образования олигомеров инактивированного актина: на первом этапе G-актин превращается в протомеры апо-актина, которые затем, конденси-руются в сплюснутые олигомерные сплюснутые шарики, содержащие примерно 14-16 протомеров, которые были охарактеризованы ранее и которые являлись монодисперсными ассоцитами, и, наконец, эти ассоциаты соединяются в одномерные цепочки, типа «ожере-лья из бусинок». В совокупности эти наблюдения указывают на многоступенчатый путь сборки I-актина. Эта четвертичная организация обеспечивает правдоподобную физиче-скую основу для коротких олигомеров актина, наблюдаемых в ядре и, согласно литератур-ным данным, накапливающихся при заболеваниях и старении. Принцип организации этих структур похож на принцип полимеризации G-актина с образованием F-актина, однако мо-номерами этих структур являются ассоциаты актина из 14-16 протомеров, таким образом диаметр этих олигомеры значительно больше по сравнению с F-актином, и они значитель-но короче F-актина, что хорошо совпадает с упоминающимися в литературе «короткими олигомерами» актина. Это существенный шаг на пути к пониманию структуры «коротких олигомеров» актина. Следующим этапом должно стать исследование механизмов образования монодисперных ассоциатов, содержащих 14-16 протомеров инактивированного актина и представляющих собой «бусинки», из которых образованы «короткие олигомеры», а также эксперименты in cellular. По результатам исследований подготовлена статья: Yury L. Ryzhykau1, Daria D. Kuklina, Ivan O. Bezruchko, Maria V. Tishkova, Tatiana A. Golozubova, Ekaterina V. Laptenkova, Elizaveta A. Dronova, Egor V. Zinovev, Tikhon Kurkin, Andrey Rogachev, Alexander I. Kuklin, Vladimir N. Uversky, Konstantin K. Turoverov, Alexander V. Fonin and Irina M. Kuznetsova. Chain-like supramolecular assemblies of inactivated actin oligomers reveal a multistage assem-bly pathway. Статья принята к печпти в журнале Biochemical and Biophysical Research Communications. Изложенные выше исследования были выполнены на альфа-актине из мышц кролика, однако в ядрах немышечных клеток содержится бета-актин. В связи с этим мы предприняли изучение инактивированного актина рекомбинантного бета-актина из Pichia Pastoris. Методами собственной флуоресценции, кругового дихроизма и динамического светорассеяния показали, что не только эти две изоформы актина практически идентичны, но и свойства этих актинов, инактивированных путем прогревания практически идентичны. Также как и инактивированный актин из мышц кролика рекомбинанатный актин из Pichia Pastoris инактивированный путем нагревания до 60 град С представляет собой монодисперсный ассоциат состоящий из 14-16 мономеров, в которых полярные области находятся внутри структуры, а гидрофобные области, напротив, образуют внешнюю поверхность, т.е. это структура, принципиально отличающаяся от структуры канонической белковой глобулы. Расположенные на поверхности гидрофобные остатки естественно приводят с агрегации этих структур, удивительным, и пока не понятым остается тот факт, что происходит ассоциация строго определенного количества этих структур, а именно 14-16 мономерных единиц, что приводит к образованию монодисперсных ассоциатов, как выяснилось имеющих форму сплющенных шариков, «бусинок», которые затем способны соединяться образую «короткие олигомеры». На основании полученных результатов подготовлена статья, направленная в журнал Biochimica et Biophysica Acta: Maria V. Tishkova, Tatiana A. Golozubova, Aleksey V. Artemov, Vladislav A. Reushev, Iuliia A. Antifeeva, Alexander V. Fonin, Konstantin K. Turoverov, Vladimir N. Uversky, Irina M. Kuznetsova/ Spectral properties of α- and β-actin isoforms. Эти результаты подтверждают существующие в литературе представления о том, что функциональные особенности изоформ актина определяются не на белковом, а на генети-ческом уровне. Как известно, шесть изоформ актина кодируется шестью различными ге-нами, при этом различия в генах больше, чем в аминокислотных последовательностях и в структуре белков, хотя белки этих изоформ невзаимозаменяемы. Механизм, определяющий различную локализацию и различные свойства изоформ не известен. Существует предпо-ложение, о том, что существенную роль в этом может играть mRNAs изоформ актина и связанные с ними белки. В связи с этим в настоящей работе был проведен биоинформати-ческий анализ белков, взаимодействующих с mRNAs различных изоформ актина и выяв-лены их особенности. По результатам исследования подготовлена статья, направленная в журнал International Journal of Biological Macromolecules : Yakov I. Mokin, Maria Tishkova, Vladimir N. Uversky, Konstantin K. Turoverov, Irina M. Kuznetsova, and Alexander V. Fonin Bioinformatic analysis of proteins interacting with mRNAs of different actin isoforms.