Генетическая вариабельность возбудителя и патогенетические особенности течения лейкоза у восприимчивых животных для усовершенствования системы диагностики и ликвидации заболевания

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-16-00103

НазваниеГенетическая вариабельность возбудителя и патогенетические особенности течения лейкоза у восприимчивых животных для усовершенствования системы диагностики и ликвидации заболевания

Руководитель Донник Ирина Михайловна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук" , Свердловская обл

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-203 - Ветеринария

Ключевые слова вирус лейкоза КРС, вариабельность генотипов вируса лейкоза, генотипирование, провирусная нагрузка, патогенетические особенности лейкоза, межвидовая передача.

Код ГРНТИ68.39.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на изучение генетической вариабельности возбудителя лейкоза крупного рогатого скота, патогенетических особенностей и воздействия на макроорганизм животных в зависимости от генотипа возбудителя, повышение эффективности системы диагностики и ликвидации болезни, имеющих фундаментальное и прикладное значение для ветеринарной науки, отрасли животноводства в целом, а также повышения качества сельскохозяйственной продукции. Изучение свойств патогена и прогнозирование возможностей передачи активной инфекции другим видам, включая человека, является приоритетной задачей для гуманитарной медицины. Лейкоз является широко распространенным (включая Российскую Федерацию) неизлечимым инфекционным заболеванием крупного рогатого скота, наносящим значительный ежегодный экономический ущерб отрасли сельского хозяйства. Вирус лейкоза обладает определенной изменчивостью, а разные его штаммы с конкретными аминокислотными заменами в структурных и регуляторных генах также имеют характерные различия в инфекционных свойствах. Помимо этого, генетическая вариабельность отдельных изолятов вируса лейкоза влияет на эффективность диагностики и ликвидацию заболеваний в популяциях крупного рогатого скота. В рамках проекта будет проведено эпизоотологическое обследование сельскохозяйственных предприятий и изучение генетического разнообразия патогена с использованием методов ДНК – секвенирования (в том числе полногеномное) и биоинформатической обработки. В каждом случае будет определена генетическая группа вируса и установлены аминокислотные замены в структурных и функциональных белках патогена. Изучение иммунобиологических свойств вируса лейкоза будет осуществлено при экспериментальном и естественном заражении на лабораторных животных (мелкий рогатый скот) и крупном рогатом скоте с применением клинических, гематологических и современных иммунологических и молекулярно – генетических методов исследований. Для оценки степени вовлечения организма животного в инфекционный патологический процесс будет разработана и использована методика оценки провирусной нагрузки. Комплексное обследование животных в сравнительном аспекте позволит выявить патогенетические особенности течения патологического процесса и установить степень влияния конкретного выявленного генотипа на скорость течения лейкозного процесса и тяжесть заболевания. Одной из задач проекта станет разработка протоколов для «отечественной» (полностью с использованием российских компонентов) специфичной и чувствительной диагностической ПЦР тест-системы для определения вируса лейкоза в популяциях крупного рогатого скота с учетом генетической вариабельности, основанной на изучении нуклеотидных последовательностей доминирующих генетических вариантов вируса лейкоза. Полученные новые сведения об иммунологических свойствах, выявленных доминирующих генетических групп вируса лейкоза позволят на этапах проекта усовершенствовать научно-обоснованные программы оздоровления от инфекции в сельскохозяйственных предприятиях различных субъектов страны. Другим этапом проекта станет изучение возможностей межвидовой передачи BLV при помощи NGS – секвенирования неопластических тканей, отобранных у других видов животных, в том числе домашних животных-компаньонов человека.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Донник И.М., Петропавловский М.В., Макутина В.А., Гулюкин М.И., Барсуков Ю.И. Современная ситуация по распространению лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации Ветеринария, №11. С. 18-22 (год публикации - 2024)
10.30896/0042-4846.2024.27.11.18-22

2. Донник И.М., Петропавловский М.В., Гулюкин М.И., Кривонос Р.А., Черных О.Ю., Палагин С.Ю. Эффективность противолейкозных мероприятий на административных территориях Российской Федерации с разной эпизоотической обстановкой Ветеринария и кормление (год публикации - 2024)

3. Донник И.М., Гулюкин М.И., Петропавловский М.В., Исаева А.Г., Кривоногова А.С., Макутина В.А. Генетическая вариабельность возбудителя лейкоза крупного рогатого скота на территориях с различной эпизоотической ситуацией Ветеринария и кормление (год публикации - 2024)

4. Петропавловский М.В., Донник И.М., Исаева А.Г., Мартынов Н.А., Кривоногова А.С., Черных О.Ю. Разработка высокочувствительной ПЦР тест-системы для детекции вируса лейкоза крупного рогатого скота Ветеринария Кубани (год публикации - 2026)

5. Донник И.М., Петропавловский М.В., Исаева А.Г., Кривоногова А.С., Мартынов Н.А. Динамика провирусной нагрузки у животных с разным генотипом возбудителя лейкоза Аграрный вестник Урала, Т. 25, № 11, С. 1855-1864 (год публикации - 2025)
10.32417/1997-4868-2025-25-11-1855-1864

6. Петропавловский М.В., Донник И.М., Кривоногова А.С., Исаева А.Г., Бадретдинова А.С., Мартынов Н.А. Генетическая гетерогенность и патогенетические механизмы вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) Foods and Raw Materials (год публикации - 2026)

7. Исаева А.Г., Петропавловский М.В., Донник И.М., Мартынов Н.А., Кривоногова А.С., Черных О.Ю. Анализ диагностической эффективности разработанной ПЦР-системы для выявления вируса лейкоза КРС в сравнении с коммерческим аналогом Труды Кубанского государственного аграрного университета (год публикации - 2026)

8. Порываева А.П., Донник И.М., Исаева А.Г., Петропавловский М.В., Кривоногова А.С., Черных О.Ю. Иммунологические показатели крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза разных генотипов Аграрный вестник Урала (год публикации - 2026)

9. Петропавловский М.В., Донник И.М., Кривоногова А.С., Исаева А.Г., Бадретдинова А.С., Мартынов Н.А. Филогенетический анализ вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) на территории Российской Федерации: происхождение, эволюционные траектории и эпизоотические последствия Сельскохозяйственная биология (год публикации - 2026)

10. Порываева А.П., Донник И.М., Исаева А.Г., Дроздова Л.И., Петропавловский М.В., Кривоногова А.С., Палагин С.Ю. Особенности течения лейкозного процесса у экспериментальных животных Аграрный вестник Урала (год публикации - 2026)

11. Петропавловский М.В., Донник И.М., Исаева А.Г., Кривоногова А.С., Мартынов Н.А.,Черных О.Ю. Разработка методики определения уровня провирусной нагрузки при лейкозе крупного рогатого скота на основе количественной ПЦР в реальном времени Труды Кубанского государственного аграрного университета (год публикации - 2026)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Установлено, что G4 генотип отмечен в территориях с напряженной эпизоотической ситуацией. В Свердловской области выявили, что G7 генетический тип возбудителя лейкоза не изменялся на протяжении 14 лет, при этом эпизоотическая ситуация в субъекте была стабильна, инфицированность животных не превышала 0,04%. 2. Установлено, что основные аминокислотные замены были локализованы в эпитопах: G – T47A, P73A, A119T, H121R; H – S56F; Т-клеток CD8+ (N5) – D81N, N84D; нейтрализующем домене 2 (ND2) - I144T, L149V, K150R, эпитопе Т-клеток CD8+ (N11 и N12) и цинк-связывающей области полипротеина gp51(SU) – L155I, D166G (таблица 2). Некоторые выявленные аминокислотные замены уже описаны ранее [Sultanov A. et al, 2022, Suzuki A. et al, 2020], однако ряд замен являлись уникальными (T47A, A119T, D81N, N84D, L155I, D166G). Впервые идентифицированы образцы G4 генетического типа, имеющие замену H121R, характерную для G7 изолятов, что вероятно свидетельствует о взаимных рекомбинациях нуклеотидов. Установлено, что наибольше количество аминокислотных замен выявлено среди изолятов G4 генетической группы возбудителя лейкоза. В то же время последовательности G7 генетического типа были более консервативны. Нуклеотидные замены в участках env гена gp51 (SU), ассоциированных с инфекционностью, репликацией и патогенезом возбудителя лейкоза вероятно и вызвали более злокачественное течение заболевания у животных. Для дальнейшего детального изучения генетических характеристик на 3 этапе реализации проекта будет проведено полногеномное ДНК – секвенирование биоматериала, для чего уже разработаны протоколы исследований и подобраны праймеры. 3. Разработан дизайн и протоколы исследований, включая следующие этапы. В ходе выравнивания нуклеотидных последовательностей провируса лейкоза и последующей биоинформатической обработки данных, были получены консенсусные последовательности для каждого гена и сконструированы специфичные олигонуклеотиды. Подобраны комплекты праймеров, для разных участков генома провируса лейкоза крупного рогатого скота. В качестве потенциальных мишеней, были выбраны гены: LTR, ENV, GAG, POL, TAX. Также для каждой пары праймеров были разработаны гидролизные зонды. Экспериментально установлено, что для определения числа копий провируса методом количественной ПЦР наиболее высокий и стабильный уровень эмиссии и отсутствие образования неспецифичных продуктов реакции в градиенте температур от 64 оС до 56 оС обеспечил комплект нуклеотидов ENV_1194, ENV_1390, ENV_1284_IO, инициирующий амплификацию гена ENV возбудителя лейкоза. Многократной экспериментальной серией разработан протокол для определения провирусной нагрузки методом ПЦР у инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных. Суммарная эффективность реакции для всех стандартов составила E= 80,0%, а коэффициент корреляции – 0,998. Наименьшее значение стандартного отклонения пороговых циклов составляло 0,029, наибольшее – 0,265, что указывает на высокую воспроизводимость полученных результатов. Дополнительно экспериментально установлен коэффициент вариации полученных данных, он составил 10.2%, что подтверждает эффективность разработанного метода. Разработанные олигонуклеотиды дополнительно исследовали с целью возможности их применения для разработки эффективной ПЦР тест-системы для диагностики вируса лейкоза, учитывающую генетический тип возбудителя лейкоза и уровень провирусной нагрузки, исключая получение ложноотрицательных результатов. Результаты исследований будут использованы на 3 этапе реализации проекта. 4. Проведено изучение патогенетических особенностей BLV-инфекции у мелкого рогатого скота с разными генетическими группами вируса лейкоза. Результаты исследований показали развитие в организме животных патологического процесса, об интенсивности которого судить по полученным результатам пока не представляется возможным. Это связано с тем, что, лейкоз, как заболевание, характеризуется медленным развитием патологических изменений в системе гемопоэза. Произведена оценка провирусной нагрузки методом полимеразной цепной реакции на клинических образцах. Согласно полученным данным у крупного рогатого скота из Краснодарского края, где на момент эпизоотологического обследования складывалась наиболее напряженная ситуация по лейкозу и установили доминирование G4 генетического типа возбудителя, отмечали наиболее высокие значения провирусной нагрузки, в сравнении с остальными обследуемыми административными территориями РФ. Установлено, что у исследованных животных (n=42), c установленным секвенированием генотипом возбудителя лейкоза G4, среднее значение провирусной нагрузки составляло 12224,8 копий/100 нг, а у животных с выявленным G7 генетическим типом (n =11) – 1148,65 копий/100 нг. Выявлено, что среднее значение провирусной нагрузки у животных с содержанием лейкоцитов в пределах нормативных показателей менее 14.0 * 109 (n = 29) составляло 1492,18 копий/100 нг, в пределах от 14,0 * 109 до 25,0* 109 (n= 29) – 8299,99 копий/100 нг, с выраженным лейкоцитозом – более 25,1 * 109(n=17), – 17291,83 копий/ 100 нг. Также проведено изучение и определены показатели провирусной нагрузки у экспериментальных животных. Отобранный материал анализируется. Результаты исследований будут включены в комплексный многофакторный анализ на 3 этапе реализации проекта. Скорость развития патологического процесса при лейкозе является важным показателем. Увеличение провирусной нагрузки опосредует распространение патогена в популяции. Согласно эпизоотологическим клиническим, иммунологическим, молекулярно-генетическим и другим экспериментальным исследованиям вывод о более злокачественном течении лейкоза при генотипе G4 подтверждается. Согласно плану, продолжены работы по отбору и подготовке образцов нормальных и неопластических тканей от животных-компаньонов человека (собак и кошек) для выполнения работ третьего этапа. За период декабрь 2023 - ноябрь 2024 г. исследовано 190 проб. При этом выявили: новообразования (НО) – 165 случаев, в том числе злокачественного характера 120 (72,7%); доброкачественного – 45 (27,3%). Новообразования молочных желез составили 46,7% от всех выявленных (77 биоптатов), при этом злокачественный характер выявили в 58 биоптатах, что составило 75,3% от обнаруженных новообразований молочной железы.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Изучены патоморфологические изменения у экспериментальных овец при заражении биоматериалом от коров больных лейкозом в зависимости от генотипа возбудителя. Установлено, что генотип вируса G4 вызывал более тяжелое течение заболевания у овец и характеризовался более высокой и вариабельной провирусной нагрузкой, чем генотип вируса G7. Полученные данные имеют значение для практической ветеринарии, так как обосновывают необходимость включения мелкого рогатого скота в программы эпизоотологического мониторинга в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, поскольку инфицированные овцы могут служить дополнительным резервуаром и источником BLV - инфекции, способствуя его циркуляции в агробиоценозах. Проведен комплексный анализ, в результате которого получены новые данные о влиянии генетической вариабельности вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) на клинико-иммунологический статус инфицированных животных как в различных регионах Российской Федерации, так и в лабораторных условиях. Выявлены факторы, влияющие на тяжесть течения заболевания у животных с разным генотипом возбудителя. Уровень провирусной нагрузки у крупного рогатого скота с генотипом вируса G4 в 10,6 раз был выше такового, чем с генотипом G7 и положительно коррелировал с интенсивностью у них лейкоцитоза. Степень иммунологического дисбаланса у них более четко коррелировала со стадией лейкозного процесса, по мере прогрессирования заболевания нарастала эндогенная интоксикация. Учитывая, что провирусная нагрузка является ключевым диагностическим и патогенетическим показателем у крупного рогатого скота при лейкозе, эти данные могут иметь практическое значение при диагностике и прогнозе развития болезни. Полученные результаты вносят вклад в понимание патофизиологии лейкоза крупного рогатого скота, при этом определена ключевая роль прогрессирующей иммунной дисфункции в развитии заболевания у животных при разных генотипах BLV. Для повышения эффективности диагностических мероприятий с учетом новых молекулярно-генетических знаний о выявленных циркулирующих штаммах вируса лейкоза разработана эффективная ПЦР тест-система для диагностики вируса лейкоза, учитывающая молекулярно – генетические характеристики персистирующего возбудителя лейкоза, уровень провирусной нагрузки, исключая получение ложноотрицательных результатов. Биоинформатическими методами проведен подбор специфичных праймеров, экспериментально подобраны компоненты для реакции с использованием «отечественной» сырьевой базы и отработаны протоколы исследований. Набор олигонуклеотидов (праймеры и зонд), нацеленный на консервативный участок LTR-региона генома вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), для детекции его провирусной ДНК методом ПЦР в реальном времени, обеспечил специфичность системы к циркулирующим изолятам и минимизировал риск ложноотрицательных результатов, связанных с генетической вариабельностью вируса. Испытания разработанной тест системы позволили выявить больше положительных животных, по сравнению с коммерческой тест-системой, применяемой для этих целей. При этом накопление флуоресцентного сигнала при исследовании проб от животных разработанной ПЦР тест-системой происходило в среднем на 2.8 цикла раньше, чем при применении коммерческого набора, что имеет важное диагностическое значение. Использование данной тест-системы предполагается включить в основные этапы научно – обоснованной программы оздоровления сельскохозяйственных предприятий от лейкоза, что позволит повысить выявляемость инфицированных животных, особенно при скрытом вирусоносительстве молодняка в первые недели жизни, а также при идентификации инфицированных животных без признаков сероконверсии. На основании полученных данных скорректированы программы ликвидации инфекции в ряде молочных предприятий. Получены и описаны результаты применения методик NGS – секвенирования тканей у крупного рогатого скота. У крупного рогатого скота из разных субъектов Российской Федерации проведено NGS-секвенирование и расшифровано 15 полногеномных последовательностей BLV G4 и G7 генотипа. В дополнение к известным маркерам в env, впервые для российских изолятов показана высокая частота встречаемости аминокислотной замены L233P в онкобелке Tax, которая ранее была ассоциирована с сокращением латентного периода до развития лимфомы. Данная замена локализована в CD8⁺ цитотоксическом T-лимфоцитарном (CTL) эпитопе, что указывает на её роль в уклонении от клеточного иммунитета и прямую связь с лейкомогенностью. Выявлены патоген-ассоциированные генетические маркеры, которые являются прогностическими индикаторами повышенного онкогенного потенциала у крупного рогатого скота. Таким образом, в результате проведенного комплексного исследования по изучению генетического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) на территории Российской Федерации на основании секвенирования коротких и полногеномных фрагментов выявлены ключевые молекулярно-генетические детерминанты, ассоциированные с повышенной патогенностью и эпизоотическим распространением патогена. Проведены подбор образцов патологического материала от животных (собаки, кошки); комплексное обследование биологического материала на присутствие в нормальных и неопластических клетках фрагментов генома вируса лейкоза крупного рогатого скота. Проведено ранжирование образцов биоматериала за период реализации проекта, разработан протокол для обнаружения генов tax и gag провируса лейкоза крупного рогатого скота в неопластических тканях. В ходе выполнения молекулярно-генетических исследований, специфических фрагментов ДНК BLV в представленных неопластических тканях от животных-компаньонов обнаружено не было, однако исследования в этом направлении необходимо расширить на большем количестве разных животных с учетом расширения нозологических форм и стадийности процесса, а также с учетом расширения онкогенных маркеров.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Полученные данные имеют важное значение для практической ветеринарии, так как обосновывают необходимость включения мелкого рогатого скота в программы эпизоотологического мониторинга в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, поскольку инфицированные овцы могут служить дополнительным резервуаром и источником BLV инфекции, способствуя его циркуляции в агробиоценозах. Полученные результаты вносят вклад в понимание патофизиологии лейкоза крупного рогатого скота, при этом определена ключевая роль прогрессирующей иммунной дисфункции в развитии заболевания у животных при разных генотипах BLV. В результате проведенного комплексного исследования по изучению генетического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) на территории Российской Федерации на основании секвенирования коротких и полногеномных фрагментов выявлены ключевые молекулярно-генетические детерминанты, ассоциированные с повышенной патогенностью и эпизоотическим распространением патогена, что позволит усовершенствовать программы оздоровления предприятий от лейкоза.