Эмерджентные патогены рода Cronobacter (E. sakazakii) в продуктах для питания детей отечественного производства: новые аспекты безопасности

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-16-00163

НазваниеЭмерджентные патогены рода Cronobacter (E. sakazakii) в продуктах для питания детей отечественного производства: новые аспекты безопасности

Руководитель Ефимочкина Наталья Рамазановна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-302 - Функциональные и специальные продукты питания

Ключевые слова Бактерии рода Cronobacter (E.sakazakii), патогенные микроорганизмы, факторы патогенности, микробная контаминация, смеси инстантные для детского питания, технологии

Код ГРНТИ65.09.05

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Потребительский спрос на специализированные продукты для искусственного вскармливания детей, несмотря на широкую пропаганду и поддержку грудного вскармливания, не снижается. Растёт потребность и в продуктах прикорма, в том числе в связи с возможностью их обогащения эссенциальными нутриентами. Для этого пищевая промышленность непрерывно развивает ассортимент продукции для детей 1 года жизни, однако именно этот контингент является наиболее восприимчивым к инфекционным агентам. Соответственно, ведущим приоритетом для производителей является обеспечение безопасности продукции, а наиболее важным её аспектом - необходимость защиты от инфекции, обусловленной новым облигатно патогенным для младенцев возбудителем - Cronobacter spp. (ранее - E.sakazakii), способным вызывать тяжелые инфекции, включая менингиты, бактериемию, некротизирующий энтероколит (НЭК) при потреблении контаминированных детских смесей. В группе наиболее высокого риска - новорожденные и недоношенные дети. Частота регистрации этих заболеваний стала расти с увеличением искусственного вскармливания и в последние 20 лет НЭК данной этиологии зафиксирован у 70% заболевших. У новорождённых заболеваемость составляет 0,3%, у недоношенных – до 25%. Показатели смертности достигают 60%, особенно у детей с низкой массой тела при рождении. Последствия перенесенных инфекций данного генеза ведут к пожизненной инвалидизации. По культуральным признакам Cronobacter мало отличаются от близкородственных колиформ, но по ряду свойств приближаются к инвазивным видам энтеробактерий. Они обладают повышенной устойчивостью к воздействию температур и высушиванию, могут переживать пастеризацию и быстро прорастать в восстановленных смесях. Это подчёркивает серьёзность проблемы и необходимость мер со стороны изготовителей против попадания возбудителя в производственную цепь. Имеются научные прогнозы, что в силу способности к быстрой эволюции возбудитель будет широко распространяться в сухих смесях и других продуктах на молочной основе. ВОЗ официально признала Cronobacter spp. облигатным патогеном для детей раннего возраста и заявила об обязательности внедрения мер управления риском путём нормирования патогена в сухих смесях. В России установлен микробиологический норматив безопасности, регламентирующий отсутствие E. sakazakii в специализированных продуктах для детей 1 года жизни, предусматривающий контроль продукции только при выявлении в ней бактерий Enterobacteriaceae (двухстадийный подход), разработаны методы контроля. Тем не менее очевидна необходимость повышения уровня безопасности и выявления причин, снижающих эффективность существующих систем контроля детской продукции. Для Cronobacter spp. это диктуется не только адаптацией генотипов, циркулирующих в сырье и продуктах, к параметрам отечественных технологий, но и расширением контингента восприимчивых к агенту детей. Также важно то, что число детей, родившихся недоношенными, растет с 1990 г., а с 2012 г. согласно рекомендаций ВОЗ к ним стали относить недоношенных с 22 недель гестации. На рынке детского питания в РФ до настоящего времени превалировала импортная продукция и при контроле смесей из промышленно развитых стран находки Cronobacter были единичными. В условиях экономических санкций и перехода на преимущественно собственное производство требуется максимально жёсткая оценка безопасности отечественных смесей и компонентов в отношении возбудителя. Важной является оценка продукции из Юго-восточной Азии и Китая, где могут применяться технологии, эффективность которых в отношении Cronobacter неизвестна. Очевидна необходимость актуализации методов анализа Cronobacter spp. в плане оценки факторов патогенности и их связи с циркулирующими генотипами на территории РФ. Все изложенное обосновывает необходимость исследований по совершенствованию контроля и оценке эффективности технологий производства отечественных детских смесей и каш, для снижения риска возникновения инфекций Cronobacter spp., сохранения жизни и здоровья будущих поколений.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ефимочкина Н.Р., Зинурова Е.Е., Смотрина Ю.В., Стеценко В.В., Полянина А.С., Маркова Ю.М., Шевелева С.А. Оценка чувствительности пищевых изолятов Cronobacter sakazakii и других энтеробактерий к температурным стрессам и хлорсодержащим биоцидам Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2024. Т. 177. № 1. С. 113-119 (год публикации - 2024)
10.47056/0365-9615-2024-177-1-113-119

2. Полянина А.С., Быкова И.Б., Симоненко Е.С., Ефимочкина Н.Р., Шевелёва С.А. Обоснование путей снижения контаминации бактериями рода Cronobacter сухих специализированных продуктов для детского питания на этапе их производства Анализ риска здоровью, 2024. № 1. С 59-70 (год публикации - 2024)
10.21668/health.risk/2024.1.06

3. Маркова Ю.М., Полянина А.С., Смотрина Ю.В., Стеценко В.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Применение ПЦР-анализа для выявления Cronobacter spp. в продуктах для детского питания Материалы IV Национального конгресса с международным участием по экологии человека, гигиене и медицине окружающей среды «Сысинские чтения 2024»: сборник тезисов. – Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2024. – 198 с., 2024. С 87-88 (год публикации - 2024)

4. Симоненко Е. С., Ефимочкина Н. Р., Шевелева С. А. Эмерджентные патогены рода Cronobacter (E. sakazakii) в продуктах для питания детей раннего возраста Пищевая промышленность, 2024. № 12. С. 116-119 (год публикации - 2024)
10.52653/PPI.2024.12.12.023

5. Маркова Ю.М., Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Смотрина Ю.В., Полянина А.С., Стеценко В.В., Быкова И.Б. Изучение молекулярно-биологических характеристик бактерий рода Cronobacter, выделенных из сухих детских пищевых продуктов Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, том 179, № 1, с.63-67 (год публикации - 2025)
10.47056/0365-9615-2025-179-1-63-67

6. Ефимочкина Н.Р, Шевелёва С.А., Маркова Ю.М., Смотрина Ю.В., Быкова И.Б., Полянина А.С., Стеценко В.В., Симоненко Е.С. Эмерджентные патогены рода Cronobacter в продуктах для питания детей в России: характеристики контаминации, пути минимизации Актуальные вопросы переработки мясного и молочного сырья, выпуск 18, с.272-279 (год публикации - 2024)

7. Полянина А.С., Маркова Ю.М., Стеценко В.В., Смотрина Ю.В. Оценка загрязнённости бактериями рода Cronobacter продуктов детского питания, представленных на отечественном потребительском рынке Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы профилактической медицины и общественного здоровья»15 мая 2024 года/ под общей редакцией академика РАН, профессора Н.И. Брико. – Москва: Издательство ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 2024. — 208 с., 2024. – С.81-82 (год публикации - 2024)
-

8. Смотрина Ю.В., Шевелева С.А. Оценка антимикробной резистентности штаммов Cronobacter spp. и других энтеробактерий, выделенных из продуктов для питания детей раннего возраста и компонентов для их производства Материалы IV Национального конгресса с международным участием по экологии человека, гигиене и медицине окружающей среды «Сысинские чтения 2024»: сборник тезисов. – Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2024. – 198 с., 2024. С 138-139 (год публикации - 2024)

9. Полянина А.С., Маркова Ю.М, Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Модификация метода определения бактерий рода Cronobacter в сухих продуктах для питания детей раннего возраста Вопросы питания, том 94, № 3 (559), с.41-47 (год публикации - 2025)
10.33029/0042-8833-2025-94-3-41-47

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 г. получены дополнительные сведения о контаминации бактериями рода Сronobacter сухих смесей и каш типа инстант для детей раннего возраста, циркулирующих на рынке РФ. В выборке из 46 образцов частота обнаружения патогена в среднем составила 9% при среднем уровне содержания 2,5±1,02 КОЕ/г. Наибольшие уровни патогена выявлены в кашах молочных с 4 месяцев (5 КОЕ/г). В 17% сл. в остаточной микрофлоре детских сухих продуктов обнаружены представители других таксонов Enterobacteriaceae в количестве 1,26±0,86 КОЕ/г. При исследования смывов с оборудования, инвентаря, резервуаров, а также со стен, полов и инвентаря для уборки в помещениях по производству смесей сухих инстантных для питания детей раннего возраста (СМС) полного цикла на 6 производственных участках, в том числе распылительной сушки, промежуточного хранения, азотирования, фасовки, Сronobacter spp. не обнаружено. Но в 2 сл. из 35 с полов на участке сушки и азотирования выделены их терморезистентные сателлиты Pantoea spp., что свидетельствует о возможности выживания кронобактеров на предприятии. Для повышения эффективности выявления Cronobacter spp. из сухих детских продуктов разработана модифицированная схема анализа, основанная на комбинации культуральных и/или ПЦР этапов, предусматривающая двойное обогащение и двойную селекцию на жидких и плотных средах (в том числе при максимально переносимых и оптимальных для патогена температурах), а также возможность его прямой детекции на этапе предобогащения с использованием заранее сформированной панели высокоспецифичных праймеров для рода Сronobacter и видов C.sakazakii и C. malonaticus. С помощью этой панели проведена таксономическая ПЦР-идентификация банкированных штаммов, ранее биохимически охарактеризованных, как представители 3 видов Cronobacter spp. В результате с высокой степенью достоверности все 12 культур ре-классифицированы в вид C.sakazakii. Сопутствующие Сronobacter spp. в сухих детских продуктах бактерии идентифицированы путём расширенной биохимической идентификации API 20 E (BioMerieux) как Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia, Pantoea, Serratia spp. Для определения количества патогена в продуктах методом ПЦР-детекции строили калибровочные кривые для штаммов рода Cronobacter и вида С.sakazakii по величинам Cq флуоресценции для 10-кратно убывающих концентраций экстрактов их ДНК и КОЕ живых клеток. Установили порог выявления на уровне 5х10^2КОЕ/г. Путём тестирования (при совмещении с методикой серийных разведений образцов продуктов, в которых патоген был найден при бакпосеве) подтвердили воспроизводимость методики, в трети случаев – на порядок большую чувствительность, во всех случаях - ускорение анализа на 50% и более, а главное - высокую специфичность и возможность одновременно с количеством открывать род и вид патогена. Наряду с таксономической панелью праймеров создана панель маркеров генов, отвечающих за патогенность и антигенность у кронобактеров. С её помощью у 80% изолятов C.sakazakii, выделенных из циркулирующих на рынке РФ сухих детских продуктов, установлено наличие одновременно пяти, а 20% - четырёх кодируемых механизмов развития патологии (гемолиз, захват эндогенного железа, разрушение комплемента, лизис коллагена и некроз энтероцитов, инвазивность, синтез провоспалительного липида А в ЛПС) и принадлежность к клинически значимым серотипам О1 и О2. Этим они резко отличались от сопутствующих энтеробактерий, у которых частота генов патогенности была в 3,2 раза меньше, а Cq протяжённее. Кроме того, фенотипически все кронобактеры были резистентны к антибиотикам 2-7 фармгрупп. Это подтверждает потенциальную способность данных загрязнителей вызывать инфекцию в восприимчивом организме и обусловливает важность неукоснительного контроля безопасности продукции. Разработан дизайн анализа геномов у Cronobacter spp. путём мультилокусного сиквенс типирования, внедрение которого позволит максимально достоверно устанавливать эпидемиологические связи между источниками патогена и их распространением по всей пищевой цепи. Исследования поведения Cronobacter spp. при воздействии стрессовых факторов (температуры, биоцидов, посторонних микробных контаминантов) позволили получить новые данные об их биологических особенностях. Так, в модели регидратации СМС и сухого молока показана способность C.sakazakii, внесённого в дозах на уровне сотен и тысяч клеток/г продукта, выживать при температуре 52°С вплоть до 18 минут экспозиции, 56°С – 12 минут и ингибироваться только при 60°С. В испытаниях по образованию биоплёнок (БП) в различных условиях, в том числе при совместном культивировании с представителями сопутствующих этому патогену бактерий в сухих продуктах и на объектах среды предприятий, обнаружено, что синтез БП, не характерный для кронобактера в монокультуре, активизируется в присутствии клебсиелл. Это может способствовать персистенции возбудителя при нарушениях санитарного режима производства, и неблагоприятно при попадании с пищей в ослабленный организм. При изучении биоцидного действия разных доз дихлоризоциануровой кислоты на выделенные в 2024 г. штаммы подтверждены полученные в 2023 г. данные о пониженной чувствительности кронобактеров к хлору. Эти данные важны для обоснования мер профилактики инфекции на всех этапах производства, включая промежуточные, и снижения риска контаминации патогеном сухих детских продуктов. Разработан проект Методических рекомендаций по контролю Cronobacter spp. на предприятиях по производству сухих продуктов на молочной основе для питания детей раннего возраста, предназначенный для всех заинтересованных участников в цепи производства и реализации данной продукции.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Профилактика заболеваемости детского населения инфекциями, обусловленными эмерджентным патогеном Cronobacter spp (ранее - Enterobacter sakazakii), приобретает всё большую актуальность в связи с расширением контингента восприимчивых групп детей, в том числе за счёт рождающихся недоношенными, и доказанной способностью низких доз возбудителя быстро увеличивать популяцию в специализированных продуктах детского питания сухих после регидратации. Частота таких инфекций растет с распространением искусственного вскармливания. Виды С.sakazakii и С.malonaticus обусловливают до 70% подтверждённых случаев некротизирующего энтероколита (НЭК) и других септических инфекций. Доза инфекта является экстремально низкой (менее 1 КОЕ/г), а колонизации возбудителем кишечника способствует его незрелость, отсутствие защитных факторов грудного молока и низкое биоразнообразие микробиоты у младенцев. Основным фактором передачи патогена являются сухие инстантные смеси для искусственного вскармливания (СМС), а также продукты прикорма - молочные и безмолочные каши. Исследования по идентификации факторов риска инфекций Cronobacter spp. в 2025 г. включали анализ распространенности кронобактеров и других энтеробактерий в СМС, кашах и компонентах для их изготовления; оценку генного потенциала вирулентности, патогенности и антимикробной резистентности (АМР) циркулирующих в пище штаммов Cronobacter spp. на основе ПЦР-анализа и секвенирования геномов, способности к формированию биопленок (БП). Исследовано 66 образцов СМС, продуктов прикорма на молочной и зерновой основе, компонентов для их производства. Частота обнаружения Сronobacter spp. в среднем составила 13,6%. Наибольшим содержание патогена было в кашах безмолочных и мучных компонентах (0,34 – 0,50 КОЕ/г продукта), наименьшим - в СМС и молочных компонентах (0,003 - 0,02 КОЕ/г). В 30,3 % проб обнаружены грамотрицательные бактерии 8 разных таксонов (со средним уровнем контаминации 10,3 КОЕ/г). Идентификация Cronobacter spp. подтвердила их принадлежность к видам С.sakazakii и C.malonaticus. В общем пуле энтеробактерий доля Cronobacter spp. составляла 21%, часто выявляли Enterobacter (14%), Klebsiella и Pantoea (по 11%). Для повышения эффективности детекции Cronobacter spp. в сухих детских продуктах доработана модифицированная схема анализа, основанная на комбинации культуральных и/или ПЦР этапов, предусматривающая двойное обогащение и селекцию на плотных средах при оптимальных и максимально переносимых кронобактерами температурах, а также при увеличении длительности первичного этапа культивирования. Сравнительная оценка модифицированной схемы с ГОСТ ISO 22964-2024 на выборке из 112 проб показала повышение выявляемости Cronobacter spp. на 56%, на фоне сопутствующих бактерий, присутствующих количествах, на 1-2 lg-порядка уровни целевого патогена, что подтверждает эффективность оптимизации методики по чувствительности, специфичности и селективности. Для детекции некультивируемых форм Cronobacter spp. подобран и адаптирован к пищевым изолятам метод ПЦР–РВ с использованием фотореактивного ДНК-связывающего красителя моноазида пропидия, позволяющий оценивать жизнеспособность бактерий по степени повреждения клеточных мембран. Методика может использоваться для выявления некультурабельных форм C.sakazakii для подтверждения их жизнеспособности, а также для интерпретации наличия клеток, инактивированных за счет микробицидного воздействия технологии. С использованием подобранной панели праймеров, комплементарных к маркерным конститутивным и функциональным генам рода и эпидзначимых видов Cronobacter, проведено тестирование 23 штаммов, фенотипически идентифицированных, как Cronobacter spp., и 31 культуры других таксонов. Подтверждена родовая принадлежность 100% целевых патогенов и принадлежность 78% из них к виду C.sakazakii, 69% - к клинически значимым серотипам О1 и О2. У большинства штаммов найдены гены патогенности, кодирующие лизис коллагена, разрушение комплемента, гемолиз и синтез провоспалительного липида А в ЛПС, инвазивность и способность к захвату эндогенного железа. Результаты MLST-типирования 12 штаммов C. sakazakii показали высокую гетерогенность пищевых изолятов : три из них были идентифицированы как ST693, ST943 и ST1149 типы, для других были определены вариативные сиквенс-типы, подтверждающие различия между изученными штаммами на внутривидовом уровне, преобладания какого-либо одного сиквенс-типа не обнаружено. Проведена оценка профиля АМР к клинически значимым антимикробным препаратам (АМП) 11 фармгрупп у C.sakazakii и сопутствующих грамм(-) бактерий - потенциальных возбудителей ИСМП. Установлена высокая частота АМР у пищевых изолятов кронобактеров, клебсиелл, ацинетобактеров к приоритетным АМП - бета-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам. Наиболее высокий уровень АМР был выявлен у Cronobacter spp. и Klebsiella spp.: число устойчивых штаммов достигало 70-100%. У всех Cronobacter spp. установлено наличие сочетанной АМР к 2 антибиотикам, у 20% штаммов – мультирезистентности к 10-13 АМП семи фармгрупп. Обнаружены штаммы клебсиелл и ацинетобактеров, устойчивые сразу к 5-9 АМП 3-6 фармгрупп. Методом ПЦР у 6-ти штаммов C.sakazakii, Klebsiella spp. и др. энтеробактерий обнаружен трансмиссивный ген adeF, обеспечивающий бактериям множественную устойчивость. У потенциальных агентов ИСМП K.pneumoniae и A.baumannii выявлено наличие генов бета-лактамаз расширенного спектра, карбапенемаз и металло-бета-лактамаз, а также гена эффлюксной помпы. Установлено, что Cronobacter spp. формируют биоплёнки (БП), позволяющие им выживать в условиях стрессовых воздействий, и этот процесс значимо усиливается при ассоциации патогена с клебсиеллами и ацинетобактером, также выживающих в продуктах при сушке. Способностью формировать БП в модели in vitro обладали более 80% изученных штаммов Cronobacter, преимущественно серотипа О1. Наиболее интенсивно БП нарастали при 25°С в аэробных и при 41,5°С в микроаэрофильных условиях. Усиление способности к образованию БП наблюдалось при совместном культивировании C. sakazakii с K.pneumoniae и A.baumannii. Изучение БП-образования в режиме реального времени методом импеданса показало, что его интенсивность нарастала в log-фазе роста культуры в первые 3-5 ч культивирования. Синтез матрикса БП у монокультур происходил в 1,5 раза быстрее в микроаэробных условиях; а в смеси с A.baumannii и K. pneumoniae становился значимо (в 2 и 7 раз) активнее. Результаты проведенных исследований использованы для доработки проекта «Методических рекомендаций по контролю бактерий рода Cronobacter (Enterobacter sakazakii) на предприятиях по производству сухих продуктов на молочной основе для питания детей раннего возраста»; документ направлен для утверждения в Роспотребнадзор и включен в план разработки (пересмотра) методических документов в 2026–2028 г.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В социальной сфере: - формирование научного задела для базы данных о циркулирующих эмерджентных патогенах, их сиквенс-типах и профилях АМР к клинически значимым антимикробным препаратам, в специализированных продуктах для детского и лечебного питания - для профилактики и диагностики инфекций, обусловленных кронобактерами. - научное обоснование актуализации нормативной базы контроля на наличие Cronobacter spp. включая расширение спектра контролируемой продукции, с увеличением возраста потребителей до 12 месяцев